導(dǎo)讀
疫苗在疾病預(yù)防中的地位日益重要,對(duì)疫苗質(zhì)量的要求也日益提高。近年來,在傳統(tǒng)和新型疫苗的制備中,應(yīng)用先進(jìn)的分離純化技術(shù)是提高疫苗效力降低副反應(yīng)的有效手段。本文敘述了目前疫苗分離純化的各種方法,概述當(dāng)今疫苗純化技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展。
離心
1.1 分析超速離心法
最初的高速離心機(jī)主要用于研究細(xì)胞的“提取物”，這種應(yīng)用和金屬材料的限制意味著：樣品的體積必須盡量小，于是設(shè)計(jì)了帶透明窗的轉(zhuǎn)頭，以便在離心期間測(cè)定離心池中顆粒的分布，有種特制的分析轉(zhuǎn)頭，它帶有分析池，可注入待分析的樣品。分析樣品是均一的懸液，將轉(zhuǎn)頭加速到它的操作速度，樣品顆粒按一定速度下沉，它們的大小、形狀和離心力決定了它們的沉降速度。因此，如果分析樣品是僅含一種顆粒的均一懸液，在分析池內(nèi)由于顆粒不斷沉降，一個(gè)清晰的界面將向池底慢慢移動(dòng)。如果分析樣品是一些顆粒的混合物，則每種顆粒將以它自己的速度沉降。分析超速離心法在這個(gè)基本且簡(jiǎn)單的基礎(chǔ)上很快發(fā)展起來。
1.2 差速沉淀法
差速沉淀法在原理上與分析超離心機(jī)中的分離一樣：離心管注入均一的懸液，離心期間，顆粒移向離心管底部，并在底部沉淀。離心時(shí)間選擇到剛好足以使所有的最大顆粒都沉淀，這樣得到?jīng)]有這種顆粒的上清液，這個(gè)上清液可在更高的速度下離心，以分離第二大的顆粒，如此等等。缺點(diǎn)是沉淀將是不均一的，如果控制離心時(shí)間使最大顆粒剛好全部沉淀，會(huì)造成輕度混雜，更長時(shí)間的離心將會(huì)造成更多的混雜。
“洗”沉淀物可改進(jìn)差速離心所取得的分離效果，將沉淀物在均勻的溶于介質(zhì)中，按原來沉淀過程一樣的條件再離心，可使沉淀物中混有的大小差別很大的顆粒再次分離，混雜度大大降低，盡管如此，但還不能分離大小相近的顆粒。因此，如果需要得到更好的分辨力，則必須使用其它的一些技術(shù)。
1.3 速率區(qū)帶離心法
速率區(qū)帶離心法技術(shù)最初是由Brakke（1951）提出的，本質(zhì)上這個(gè)技術(shù)是非常簡(jiǎn)單的：將小量懸液放在一平緩的密度梯度液上，用此梯度液來穩(wěn)定顆粒的沉降。由于離心，顆粒離開起始區(qū)帶而移動(dòng)，移動(dòng)的速度是由顆粒的大小、形狀和它們所受到的離心力來決定的。離心一段時(shí)間后，各種顆粒將按它們的相對(duì)速度移動(dòng)而各自分開成一系列區(qū)帶。在這種方法中，可毫不困難的分離沉降速度差為20％或差別更小的顆粒，所以速率區(qū)帶離心法擴(kuò)大了差速沉淀法的分離范圍。
和大多數(shù)技術(shù)一樣，起先存在一些問題，使它在最初的十年中未能推廣使用。速率區(qū)帶離心法不能在角轉(zhuǎn)頭中進(jìn)行，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)頭加速期間樣品會(huì)與梯度液混合，直到目前，甩開轉(zhuǎn)頭的容量還受到明顯的限制。由于沉降區(qū)帶的寬度和起始區(qū)帶一樣寬或?qū)捰谄鹗紖^(qū)帶，如果要取得滿意的分離，就要限制裝到轉(zhuǎn)頭中的樣品的體積。此外，樣品中物質(zhì)的濃度不應(yīng)太高，不然，整個(gè)帶將與梯度頂部的溶液混合，盡管此技術(shù)介紹后不久，Thomson等人便用速率區(qū)帶離心法去分離線粒體和溶酶體，但速率區(qū)帶離心法最初主要用于分析分離，例如分析聚核糖體樣品的大小，分布或RNA的大小、分布。甩開轉(zhuǎn)頭設(shè)計(jì)上的改進(jìn)，特別是引入?yún)^(qū)帶轉(zhuǎn)頭，大大擴(kuò)展了速率區(qū)帶離心法的應(yīng)用，這正是我們應(yīng)用的主要方法，這個(gè)方法也可使用垂直轉(zhuǎn)頭。
1.4 等密度區(qū)帶離心法
正如Harvy首先指出的那樣，亞細(xì)胞顆粒不僅在大小上不同，而且密度也不同。將含有活細(xì)胞的懸液放到較細(xì)胞密度更大的溶液上，由于離心，細(xì)胞在二液交界處成帶。在顯微鏡下檢查時(shí)，細(xì)胞的內(nèi)含物似乎已分至若干層內(nèi)，此分離尚不致殺死細(xì)胞，但如果增加離心的速度，細(xì)胞可分成兩部分，核與較高密度的碎片在一起。再利用這兩部分的密度差通過在有機(jī)溶劑中漂浮的方法可進(jìn)一步純化核。很久以后，才有通過在密的蔗糖溶液中沉降來純化核的工作。
大多數(shù)早期的分離是將顆粒懸于選定密度的液體中，離心后小于介質(zhì)密度的顆粒懸浮，大于介質(zhì)密度的顆粒沉淀。分段漂浮的分離方法既費(fèi)時(shí)間又麻煩，特別是分離一種以上的顆粒時(shí)更是如此，因此后來的研究者建立了等密度梯度離心技術(shù)。將要分離的顆粒懸液放至密度梯度液上，或者實(shí)際上將顆粒溶于制作梯度的溶液中，通過離心，顆粒或者上浮或者下沉，到達(dá)與它們密度相同的液體處。在這里，它們沒有重量，不管離心的時(shí)間多么長，它們?cè)僖膊灰苿?dòng)了。這些顆粒成為一系列的區(qū)帶，每種顆粒在它自己的密度區(qū)。
這項(xiàng)技術(shù)最初用于分析超速離心機(jī)，它沒有速率區(qū)帶離心法那么多的問題。1959年Beaufay等使用這項(xiàng)技術(shù)表明：在過氧化氫的合成和分解中有一組酶，在差速離心時(shí)與酶一 體沉降，而實(shí)際上它是結(jié)合在與溶酶體十分不同的微體顆粒上的（或過氧化物酶體上的）。
從那時(shí)以來，等密度梯度離心法已廣泛的應(yīng)用于生物制品的分離，然而，與速率區(qū)帶離心法相比，它有一個(gè)主要的缺點(diǎn)是等密度分離期間，顆粒不可避免的暴露在高濃度的梯度溶液中，這可引起顆粒的損傷，并可能出現(xiàn)相當(dāng)于損傷顆粒的一些格外的區(qū)帶。
膜分離技術(shù)
膜分離過程以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推動(dòng)力（如壓力差、濃度差、電位差等）時(shí)，原料側(cè)組分選擇性的透過膜，以達(dá)到分離目的。通常膜原料側(cè)稱膜上游，透過側(cè)稱膜下游。不同的膜過程使用的膜不同，推動(dòng)力也不同。膜分離技術(shù)主要分為微濾，超濾，納濾，反滲透。
層析技術(shù)
“色譜法”這一術(shù)語是俄國化學(xué)家茨維特于1903年首創(chuàng)的。他在白旗柱上用石油醚為溶劑，將綠葉中的色素分成不同顏色的區(qū)帶，顧命名為“色譜法”。其后Martin和Synge于1941年發(fā)表了液相分配色譜的論文，為液相色譜、氣相色譜、紙色譜和薄層色譜的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，為此他們獲得了諾貝爾獎(jiǎng)金。在我國于20世紀(jì)50年代后開展了這方面的工作，但所用名詞不一致?；瘜W(xué)工作者多喜用“色譜法”，而生化工作者多習(xí)慣于用“色層法”或“層析”。目前在我國有關(guān)這一類方法的名稱尚未統(tǒng)一。
色譜法是用來分離混合物中各種組分的方法。色譜系統(tǒng)包括兩相，固定相和流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流過加有樣品的固定相時(shí)，由于各組分在兩相之間的濃度比例不同，就會(huì)以不同速度移動(dòng)而分離開來。固定相可以是固體，也可以是被固體或凝膠支持的液體。固定相可以裝入柱中，展成薄層或涂成薄膜，稱為色譜“床”。流動(dòng)相可以是氣體，也可以是液體，前者稱為氣相色譜，后者稱為液相色譜。
3.1 凝膠過濾層析
又稱排阻色譜、凝膠滲透、凝膠色譜、分子篩色譜等。是液相色譜技術(shù)中以分子大小分離的一項(xiàng)技術(shù)。主要應(yīng)用于組分分離: 脫鹽、更換緩沖液、去除有害試劑，純化蛋白、多肽、多糖等生物分子，計(jì)算分子大小及分子的同質(zhì)性等。它具有快速更換緩沖液，溫和、高產(chǎn)，任何緩沖系統(tǒng)，去除聚體，以大小分離等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是低選擇性和上樣量受限制。若要提高分辨率，則可選擇檢測(cè)柱效，檢測(cè)分離度，減少上樣體積，降低流速，使用更小的介質(zhì)顆粒的介質(zhì)，連接2根層析柱等方法。
3.2 離子交換層析
離子交換色譜法是一種吸附色譜，是以分子的電荷差異來分離的。它以適用于所有的純化階段及所有的規(guī)模生產(chǎn)、可控制的、高選擇、高載量、可以濃縮樣品和高回收率等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用。此外，沒有一種離子交換是非常完美的，選擇正確的離子交換介質(zhì)至關(guān)重要，不同的樣品、不同的純化目的需要不同的離子交換介質(zhì)。另外，值得注意的是在上樣前對(duì)樣品加以處理：去除顆粒物質(zhì)（離心或過濾的方法），調(diào)整pH值及離子強(qiáng)度(使用脫鹽或緩沖液交換的方法)，上樣體積沒有限制，但蛋白含量小于柱載量，注意核酸的影響（陰離子交換）。
3.3 疏水層析
疏水層析是液相色譜技術(shù)中按生物分子的疏水性質(zhì)分離的一項(xiàng)技術(shù)，它是對(duì)離子交換技術(shù)，凝膠過濾技術(shù)，親和層析技術(shù)的補(bǔ)充。具有溫和，非變性條件純化；也是一種濃縮技術(shù)；具有高選擇性，高收率等特點(diǎn)。
3.4 親和層析
親和層析是通過生物分子之間特異性的相互作用分離生物分子的一項(xiàng)技術(shù)。它是一門特別容易使用的方法，具有簡(jiǎn)單易行，高純度，濃縮樣品等特點(diǎn)。更以純化蛋白質(zhì)尤為常見，因?yàn)樗菀资褂?，一步純化能使純度大?5％，去除特異雜質(zhì)，快速分離。廣泛的應(yīng)用于單克隆抗體和多克隆抗體的分離，融合蛋白的分離，酶的分離，DNA結(jié)合蛋白的分離，任何蛋白可以結(jié)合它的配體。
展望
近年來，在傳統(tǒng)和新型疫苗的制備中，應(yīng)用先進(jìn)的分離純化技術(shù)是提高疫苗效力降低副反應(yīng)的有效手段。目前廣泛研發(fā)的病毒亞單位疫苗、流腦多糖疫苗、流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗和各類病毒的核酸(DNA)疫苗等，在研制方式、組成成分和物理、化學(xué)性質(zhì)及原始來源等諸多方面都存在或大或小的差異，其分離純化方法具有相對(duì)特殊性。
針對(duì)不同的疫苗應(yīng)選用不同的分離純化路線，但一般而言，都包括兩個(gè)基本階段：初級(jí)分離和精制純化。初級(jí)分離階段的主要任務(wù)是分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物(如果產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi))，濃縮產(chǎn)物和去除大部分雜質(zhì)等，這一階段可選用的分離方法包括細(xì)胞破碎技術(shù)、離心沉降、鹽析和超濾濃縮技術(shù)等；精制純化階段則選用各種具有高分辨率的技術(shù)，以使目的蛋白和少量干擾雜質(zhì)盡可能分開，達(dá)到所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，超速離心技術(shù)和各種層析技術(shù)成為當(dāng)前達(dá)到此目的的主要方法。
從國內(nèi)外新型疫苗和基因工程產(chǎn)品，在其分離純化技術(shù)應(yīng)用發(fā)展現(xiàn)狀可以看出：
①膜分離和超速離心純化技術(shù)在疫苗、蛋白組分、多肽及生物大分子的純化過程中有著廣闊的發(fā)展前景。用該工藝制備的疫苗，純度和性狀符合規(guī)程要求，但抗原回收率相對(duì)較低、操作繁瑣且周期長、技術(shù)設(shè)備要求高，近年來已逐漸為日臻成熟的層析技術(shù)所代替，在基因工程疫苗的研制中尤為如此；
②層析分離技術(shù)在簡(jiǎn)化操作、提高效率、節(jié)約能源及降低成本方面，顯示出越來越強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。帶有多功能配基的層析介質(zhì)和全自動(dòng)化的高效層析系統(tǒng)的推出，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍，更便于標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)施。在眾多層析法中,親和層析可能成為最有效的，從低濃度培養(yǎng)液中高效分離目的蛋白的純化方法；
③用于傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗的純化技術(shù),必須依靠各學(xué)科相關(guān)技術(shù)之間的結(jié)合而發(fā)展起來的，至今尚無一項(xiàng)技術(shù)能單獨(dú)承擔(dān)分離純化的全過程。創(chuàng)新的分離純化工藝，往往是由多項(xiàng)新技術(shù)和原有技術(shù)的優(yōu)勢(shì)組合而成。傳統(tǒng)的離心、過濾和沉淀技術(shù)更多只是作為整個(gè)疫苗分離純化工藝的起始步驟，用于初步分離過程，層析技術(shù)與沉淀、離心等傳統(tǒng)分離技術(shù)的結(jié)合已逐漸成為疫苗分離純化的主流。
