禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽類感染疾病綜合癥，分為高致病性禽流感（HPAI）和低致病性禽流感（LPAI)。H9N2亞型禽流感為低致病力禽流感。1994年我國(guó)大陸首次從雞體內(nèi)分離出H9N2亞型禽流感病毒，此后，該病毒開始在我國(guó)雞群內(nèi)蔓延，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是主要的防疫手段。本公司旨在開發(fā)高效、廉價(jià)、性價(jià)比高的禽流感疫苗。項(xiàng)目設(shè)計(jì)從細(xì)胞株篩選、反應(yīng)器培養(yǎng)、產(chǎn)毒評(píng)估及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，到后續(xù)放大至生物反應(yīng)器進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)病毒疫苗，生產(chǎn)批間差異小，成本低廉，易于放大。本工作目的在于摸索成熟穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝，并應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，制備高效廉價(jià)的禽流感疫苗。
禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，A型流感病毒宿主極其廣泛。A型流感病毒的致病性與毒株和宿主均有很大關(guān)系，不同毒株對(duì)同一宿主或同一毒株對(duì)不同宿主的致病性差異很大。H9N2亞型AIV在我國(guó)涉及范圍最為廣泛，發(fā)病率、死亡率低，但其危害也不容忽視。該病毒除造成禽呼吸道疾病外，還侵害家禽的生殖系統(tǒng)，使蛋雞產(chǎn)蛋量急劇下降或者產(chǎn)蛋達(dá)不到高峰：肉雞感染后生長(zhǎng)緩慢，降低料肉比；H9亞型AIV易與其他病毒病(如雞 新城疫等)或細(xì)菌病(如大腸桿菌病等)混合感染，可造成較高的死亡率。犬腎上皮細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)對(duì)流感病毒敏感性高，成為流感疫苗生產(chǎn)的最佳宿主之一。本文對(duì)前期實(shí)驗(yàn)室已成功懸浮馴化的MDCK-10進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證及產(chǎn)毒評(píng)估，再到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。從搖瓶小試工藝開發(fā)，到中試及生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行全方位的工藝摸索，從而更新現(xiàn)階段以雞胚為原料進(jìn)行生產(chǎn)的固有工藝，為國(guó)內(nèi)低致病性禽流感生產(chǎn)型企業(yè)進(jìn)行全懸浮無(wú)血清大規(guī)模生產(chǎn)奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg>MDCK-10懸浮細(xì)胞由蘇州沃美生物有限公司自行馴化所得；H9N2亞型禽流感種毒為本實(shí)驗(yàn)室分離株，在SPF雞胚上進(jìn)行擴(kuò)繁復(fù)壯，收獲后作為本實(shí)驗(yàn)用毒，其雞胚半數(shù)感染量(50%egg infectious dose，EID50)為 8.50 LgEID50/0.2mL。MS01A無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基為本公司自主研發(fā)；胰酶購(gòu)自Gibco；250mL、500mL及1L搖瓶購(gòu)自美國(guó)Corning公司；自動(dòng)計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司；14L和35L玻璃反應(yīng)器購(gòu)自蘇州迪歐益生物科技有限公司；200L不銹鋼生物反應(yīng)器購(gòu)自蘇州迪歐益生物科技有限公司。<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg> 將指數(shù)生長(zhǎng)期的懸浮 MDCK-10 細(xì)胞以1.5×106cells/mL 左右的密度接種于康寧搖瓶中，裝液量為搖瓶總體積的20-30%，置于 37℃、5% CO2、130 r/min 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；后續(xù)連續(xù)傳代為用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞液稀釋至 1.5×106 cells/mL，每48h傳代一次。細(xì)胞連續(xù)傳代40代以上，進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)觀察及數(shù)據(jù)匯總，為細(xì)胞連續(xù)稀釋傳代穩(wěn)定性做數(shù)據(jù)支持。
14L反應(yīng)器連續(xù)傳代培養(yǎng)
懸浮MDCK-10上罐14L玻璃生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積6L，細(xì)胞以1.5×106cells/mL 左右的密度接種上罐，稀釋比為1:6，控制反應(yīng)器參數(shù)：溫度：37℃；轉(zhuǎn)速60rpm；pH7.15;DO：60%。在反應(yīng)器上進(jìn)行連續(xù)稀釋傳代培養(yǎng)，連續(xù)1:6稀釋穩(wěn)定傳代10代左右。對(duì)比在攪拌式反應(yīng)器上細(xì)胞培養(yǎng)的連續(xù)性及重復(fù)性。 MDCK-10細(xì)胞正常培養(yǎng)48h左右，密度增殖至8-10×106cells/mL，按新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞液體積比為1:1稀釋細(xì)胞液，接種于250mL搖瓶，裝液量50mL，設(shè)置不同接毒比例，分別為稀釋后培養(yǎng)體積的千分之一，萬(wàn)分之一，十萬(wàn)分之一，胰酶添加濃度為10μg/mL，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min。分別在培養(yǎng)48h，72h收取病毒液，凍融一次后采用雞紅細(xì)胞凝集價(jià)測(cè)定病毒滴度。確定最佳MOI與收獲時(shí)間。14L反應(yīng)器工藝驗(yàn)證及制滅活疫苗的制備
懸浮MDCK-10上罐14L玻璃生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體積6L，密度增殖至8-10×106cells/mL，按新鮮培養(yǎng)基與細(xì)胞液體積比為1:1稀釋細(xì)胞液，分別以萬(wàn)分之一培養(yǎng)體積比接種H9F6株、H9C1株、H9C2株、H9CD株，胰酶添加濃度為10μg/mL，控制反應(yīng)器參數(shù)：溫度：37℃；轉(zhuǎn)速60rpm；pH7.15;DO：60%。培養(yǎng)48-72h后收取病毒液，凍融一次后取樣測(cè)定病毒滴度。按終濃度0.1%的比例加入37%的甲醛溶液，至37℃滅活24h，期間每4h攪拌一次。接種雞胚測(cè)定滅活效果：接種于9-11日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種0.1mL，置37℃孵育。24h照胚，非特異性死亡應(yīng)不超過1枚。24h后每日照胚2次，觀察5日。對(duì)所有胚液分別測(cè)定血凝價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)血凝。并盲傳一代，測(cè)定血凝價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)血凝，則判定滅活完全。
將四種滅活抗原（H9F6株、H9C1株、H9C2株、H9CD株），分別用滅菌生理鹽水進(jìn)行2倍稀釋和4倍稀釋，稀釋后加入分別加入6%的吐溫-80，充分混合后為水相，油相為白油。按照水相：油相為1:3的比例乳化制苗。
取21日齡SPF雞，分為8組，每組10只，第一組到第八組分別為H9F6株稀釋2倍組；H9C1株稀釋2倍組；H9C2株稀釋2倍組；H9CD株稀釋2倍組；H9F6株稀釋4倍組；H9C1株稀釋4倍組；H9C2株稀釋4倍組；H9CD株稀釋4倍組。每組免疫相應(yīng)滅活疫苗，0.2ml/只。另設(shè)空白對(duì)照組5只，不做免疫。分別在免疫后14日、21日采血分離血清，測(cè)定H9血清抗體效價(jià)。細(xì)胞滅活苗與胚苗滅活苗免疫效果對(duì)比
（1）細(xì)胞滅活苗的制備
按照05和06方法制備H9CD株細(xì)胞滅活疫苗。
（2）胚毒滅活苗的制備
將H9CD株用滅菌生理鹽水稀釋10-4-10-5，經(jīng)尿囊液接種10-11日齡易感雞胚，每胚0.1ml。選擇接種后48-120h內(nèi)死亡雞胚及120h存活雞胚，置2-8℃冷卻24h，收獲雞胚尿囊液，按照05方法進(jìn)行滅活及滅活檢驗(yàn)，按照06方法乳化制苗。
（3）SPF雞的免疫
取21日齡SPF雞，分為2組，每組5只，第一組免疫H9CD株細(xì)胞毒滅活疫苗，第二組免疫H9CD株滅活疫苗，0.2ml/只，另設(shè)空白對(duì)照組5只，不做免疫。分別在免疫后14日，21日采血分離血清，測(cè)定H9血清抗體效價(jià)。
<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg> 搖瓶連續(xù)培養(yǎng)40代，細(xì)胞密度穩(wěn)定在8.8×106cells/ml-9.6×106cells/ml之間，細(xì)胞活率穩(wěn)定在97%-99%之間，表明MDCK細(xì)胞在搖瓶上可以穩(wěn)定傳代。<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg>反應(yīng)器連續(xù)稀釋培養(yǎng)分析
MDCK-10細(xì)胞在14L反應(yīng)器連續(xù)稀釋培養(yǎng)10代，細(xì)胞密度穩(wěn)定在8.9×106cells/ml-9.4×106cells/ml之間，葡萄糖殘量在培養(yǎng)F1-F5時(shí)持續(xù)下降，培養(yǎng)F6-F10時(shí)穩(wěn)定在1.0g/L~1.5g/L，表明MDCK-10細(xì)胞在14L反應(yīng)器上能夠穩(wěn)定傳代。<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg><svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg>
在搖瓶上按不同接毒比例接種H9毒株，接毒后分別在48h、72h、96h取樣，凍融一次后測(cè)定病毒含量。結(jié)果顯示按0.001%體積比接毒時(shí)，病毒效價(jià)在72h達(dá)到高峰，雞紅細(xì)胞凝集價(jià)為9log2HAU/25ul；按0.01%、0.1%體積比接毒時(shí)，病毒效價(jià)均在72h達(dá)到高峰，雞紅細(xì)胞凝集價(jià)為11log2HAU/25ul。為了節(jié)省種毒在大生產(chǎn)上的使用量，確定最佳接毒比例為培養(yǎng)體積比的0.01%，收獲時(shí)間為接毒后72h。 接毒后不同時(shí)間點(diǎn)取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)，并測(cè)定細(xì)胞活率。結(jié)果顯示不同接毒比例細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)48h內(nèi)有所上升，48h后細(xì)胞數(shù)開始下降；不同接毒比例細(xì)胞活率在接毒后持續(xù)下降，96h后細(xì)胞活率僅在20%-26%之間，且接毒比例越高，細(xì)胞活率下降越快。<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg>
H9F5株、H9C1株、H9C2株、H9CD株四種毒株接種14L反應(yīng)器，72h收獲凍融一次測(cè)定病毒含量，四種毒株的血凝價(jià)均為1:1024，雞胚半數(shù)感染量H9CD株略高8.6lgEID50/0.2ml，H9C1株最低，為8.6lgEID50/0.2ml。將四種抗原用0.1%甲醛溶液滅活后，做滅活檢驗(yàn)，四種抗原滅活檢驗(yàn)均合格。將抗原分別用滅菌生理鹽水進(jìn)行2倍稀釋和4倍稀釋后乳化制備疫苗。
<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg>
將制備疫苗免疫21日齡SPF雞，免疫21日后采血測(cè)定血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，免疫14日及21日后，2倍稀釋組抗體效價(jià)均高于4倍稀釋組。免疫14日后，H9C2株免疫血清抗體效價(jià)最低，2倍稀釋為1:25.5，4倍稀釋為1:23.6；H9CD株免疫抗體效價(jià)最高，2倍稀釋為1:28.7，4倍稀釋為1:27.4。免疫21日后H9C1株免疫血清抗體效價(jià)最低，2倍稀釋為1:25.2，4倍稀釋為1:24.4；H9CD株免疫抗體效價(jià)最高，2倍稀釋為1:29.4，4倍稀釋為1:28.6。根據(jù)14日及21日血清抗體效價(jià)結(jié)果，篩選出H9CD株為疫苗株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 注：空白對(duì)照組5只血清抗體效價(jià)均為0
<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg>細(xì)胞滅活苗與胚苗滅活苗免疫效果對(duì)比
將H9CD株分別用細(xì)胞及非免雞胚進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定半成品抗原效價(jià)，細(xì)胞毒雞紅細(xì)胞血凝價(jià)為1:2048，雞胚半數(shù)感染量為8.75lgEID50/0.2ml；胚毒雞紅細(xì)胞血凝價(jià)為1:2048，雞胚半數(shù)感染量為8.6lgEID50/0.2ml。將三種抗原用0.1%甲醛溶液滅活后，做滅活檢驗(yàn)，三種抗原滅活檢驗(yàn)均合格，乳化制備疫苗。將疫苗免疫21日齡SPF，免疫14日、21日采血測(cè)定血清抗體效價(jià)。結(jié)果顯示在免疫14日后，混合組苗抗體效價(jià)平均值為1:28.4，高于胚毒的1:26.8和細(xì)胞苗的1:27.28；免疫21日后，細(xì)胞苗和胚苗兩組抗體效價(jià)相當(dāng)，細(xì)胞毒抗體效價(jià)平均值為1:210.2，胚毒為1:210.4。說明細(xì)胞毒與胚毒免疫效果相當(dāng)，且細(xì)胞毒抗體產(chǎn)生比胚毒快?；旌辖M苗的效價(jià)平均值為1:211.2，均高于細(xì)胞毒和胚苗，說明混合組苗既有胚苗良好的免疫原性，又兼顧了細(xì)胞苗免疫快速應(yīng)答。<svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg><svg viewbox="0 0 1 1" style="float:left;line-height:0;width:0;vertical-align:top;"></svg> 1、在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，確定了搖瓶培養(yǎng)過程中，裝液量20-30%細(xì)胞均能正常增值，且保持良好的細(xì)胞狀態(tài)，在反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)過程中，確定了參數(shù)：溫度：37℃；轉(zhuǎn)速60rpm；pH7.15;DO：60%，細(xì)胞能在14L反應(yīng)器上進(jìn)行連續(xù)稀釋傳代，細(xì)胞增值穩(wěn)定，且培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，可以保持細(xì)胞良好狀態(tài)，并進(jìn)行后續(xù)接毒； 2、 通過毒株篩選動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，確定了H9N2-CD株免疫效果最好，抗體產(chǎn)生更快更高； 3、與傳統(tǒng)胚苗對(duì)比，細(xì)胞苗完全不弱于胚苗，且免疫效果相當(dāng)，但混合使用效果更好。
