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        使用本公司研發(fā)的個(gè)性化培養(yǎng)基對(duì)雞肝癌細(xì)胞（LMH細(xì)胞）多代次的懸浮傳代培養(yǎng)，考察細(xì)胞生長(zhǎng)和FAdV-4擴(kuò)增的穩(wěn)定性。進(jìn)一步采用單因素實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）、培養(yǎng)液稀釋比例等工藝參數(shù)對(duì)病毒效價(jià)的影響。建立了LMH細(xì)胞懸浮培養(yǎng)擴(kuò)增FAdV-4的生產(chǎn)工藝，操作簡(jiǎn)便，易于放大，為當(dāng)前FAdV-4C疫苗的滾瓶生產(chǎn)工藝替代成大規(guī)模的反應(yīng)器生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。

      Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感，在我國(guó)雞群中發(fā)病率較高，全國(guó)范圍內(nèi)均有流行，并且2010年后逐年上升趨勢(shì)。Ⅰ群禽腺病毒的宿主范圍越來(lái)越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病。FAdV-4C屬于Ⅰ群禽腺病毒，能引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)，導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降甚至死亡(死亡率在20％～80％)。主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死，肝細(xì)胞中見(jiàn)核內(nèi)包涵體。FAdV-4C對(duì)雛雞的致病力最強(qiáng)，可通過(guò)接觸水平傳播及垂直傳播，對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

      LMH細(xì)胞（雞肝癌細(xì)胞）對(duì)禽腺病毒病毒敏感性較高，成為腺病毒疫苗生產(chǎn)的最佳宿主之一。在我國(guó)，LMH細(xì)胞培養(yǎng)以貼壁細(xì)胞培養(yǎng)為主，操作繁瑣且需要使用高比例進(jìn)口血清，成本較高和批間質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題突出。乃至無(wú)血清的懸浮培養(yǎng)工藝則更具優(yōu)勢(shì)。然而，疫苗生產(chǎn)用的懸浮LMH細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性尚未探明，LMH細(xì)胞懸浮適應(yīng)后的產(chǎn)毒能力及相應(yīng)的工藝也需要詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究。

      本文采用高產(chǎn)株的LMH懸浮細(xì)胞株作為出發(fā)細(xì)胞株，應(yīng)用自主研發(fā)的培養(yǎng)基對(duì)其傳代培養(yǎng)8個(gè)月，考察其在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的穩(wěn)定性，并在搖瓶中建立病毒Ⅰ群禽腺病毒擴(kuò)增工藝。

將生長(zhǎng)無(wú)異常的懸浮LMH細(xì)胞按照接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml，每三天（72h）稀釋傳代，37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)傳代中考察細(xì)胞生長(zhǎng)的穩(wěn)定性。在搖瓶建立接毒工藝并優(yōu)化MOI和稀釋比例等工藝參數(shù)。

     搖瓶連續(xù)傳代累計(jì)240天，細(xì)胞形態(tài)保持良好，表面光滑圓潤(rùn)，均呈大小均一的球形，稍有結(jié)團(tuán)，每代次培養(yǎng)72h的細(xì)胞密度均可達(dá)到5.0~7.0×10⁶ cells/ml，表明該培養(yǎng)體系的傳代培養(yǎng)穩(wěn)定性較好，細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)如圖1，傳代200多天后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖2。

圖1  培養(yǎng)72h細(xì)胞狀態(tài)圖

 圖2  LMH細(xì)胞生長(zhǎng)增殖表

    MOI

    接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培養(yǎng)72h稀釋接毒，置于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，相同稀釋比例（即接毒密度）以不同的MOI進(jìn)行接毒，每24h取樣計(jì)數(shù)觀察，留樣檢測(cè)TCID₅₀/ml效價(jià)，結(jié)果顯示（圖3）。MOI越低，接種病毒后所能達(dá)到的最高TCID₅₀效價(jià)（TCID₅₀max）出現(xiàn)時(shí)間越晚；相反，MOI越高，TCID₅₀max出現(xiàn)時(shí)間越早。MOI為0.5和1.0時(shí)，HAmax均在接毒72~96h較高，其中實(shí)驗(yàn)組基本均可達(dá)9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高達(dá)到9.5lgTCID₅₀/ml。

圖3  不同MOI下，F(xiàn)AdV-4在LMH細(xì)胞中的增殖效果

     接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培養(yǎng)72h稀釋接毒，置于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，相同的MOI=1.0下以不同的接毒密度（即稀釋比例）接毒，每24h進(jìn)行取樣計(jì)數(shù)觀察，并留樣檢測(cè)TCID₅₀，結(jié)果顯示（圖4）。接毒密度越低，接種病毒后所能達(dá)到的最高TCID₅₀效價(jià)（TCID₅₀max）出現(xiàn)越早，反之，接種密度越高，TCID₅₀max出現(xiàn)時(shí)間越晚，其中實(shí)驗(yàn)組基本均可達(dá)9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高達(dá)到9.33lgTCID₅₀/ml。

圖4 不同接毒密度下，F(xiàn)AdV-4在LMH細(xì)胞中的增殖

        本研究表明本公司實(shí)驗(yàn)室馴化的LMH懸浮細(xì)胞在配套的個(gè)性化培養(yǎng)基中累計(jì)傳代培養(yǎng)240天效果良好，其傳代培養(yǎng)穩(wěn)定，且細(xì)胞各代次細(xì)胞形態(tài)良好，表面光滑圓潤(rùn)，72h細(xì)胞計(jì)數(shù)可達(dá)5.0~7.0×10⁶ cells/ml；同時(shí)在最佳的接毒條件下（即最佳接毒比例或MOI），接種貼壁培養(yǎng)制備種毒(效價(jià)為7.8~8.3lgTCID₅₀/ml)最高效價(jià)為9.50lgTCID₅₀/mL，且本研究建立的懸浮培養(yǎng)體系在中試反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)放大生產(chǎn)中已經(jīng)得到了初步的實(shí)踐論證，為后續(xù)的大規(guī)模批次生產(chǎn)提供了技術(shù)思路與支持。