腺相關(guān)病毒 (AAV) 是基因治療中使用最廣泛的傳遞機(jī)制，截至 2021 年，占基于病毒載體的基因治療管線的 82%。幾種基于 AAV 的療法已獲得批準(zhǔn)：Glybera（脂蛋白脂肪酶缺乏癥）、Luxturna（遺傳性視網(wǎng)膜疾?。?、Zolgensma（脊髓性肌萎縮癥）、Upstaza（芳香族 L-氨基酸脫羧酶缺乏癥）和最近的 Hemgenix（B 型血友?。?。超過 200 種基于 AAV 的療法正在開發(fā)中，預(yù)計到 2030 年 AAV 市場將增長 43%。
AAV 因其固有的極具吸引力的生物學(xué)特性而受到歡迎。AAV 是一種小型無囊膜病毒，可以通過長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，提供廣泛的治療靶點(diǎn)。可用的各種 AAV 血清型還提供了特異性靶向所需組織的能力。安全性方面的另一個優(yōu)勢源于 AAV 無法獨(dú)立復(fù)制。
最初于 1965 年在腺病毒樣本中發(fā)現(xiàn)，AAV 是依賴細(xì)小病毒屬的成員，需要輔助病毒感染才能復(fù)制。單鏈 DNA 基因組長度約為 4.7 kb，由兩個基因側(cè)翼的兩個反向末端重復(fù)序列 (ITR) 組成。代表基因編碼四種代表蛋白，有助于復(fù)制和包裝病毒基因組。cap 基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2 和 VP3，以及兩種非結(jié)構(gòu)蛋白：組裝激活蛋白 (AAP) 和膜相關(guān)輔助蛋白 (MAAP) 。對于治療性基因遞送應(yīng)用，重組 AAV (rAAV) 是通過用 ITR 之間所需的目的基因替換 rep 和 cap 基因來生成的。重組 AAV 有效載荷可以是單鏈或自我互補(bǔ) DNA，其中基因組自我退火成雙鏈配置，繞過轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第二鏈合成步驟。
已經(jīng)開發(fā)了幾種生產(chǎn)rAAV的方法：HEK293細(xì)胞的腺病毒感染、HEK293或BHK細(xì)胞的皰疹感染、Sf9細(xì)胞的桿狀病毒感染以及HEK293細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染。表達(dá)rep、cap和目的轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)細(xì)胞系可以用野生型腺病毒感染。或者，幼倉鼠腎 (BHK) 細(xì)胞可以被兩種重組單純皰疹病毒 (rHSV) 感染，一種含有 rep 和 cap 基因，另一種含有轉(zhuǎn)基因。第三種方法涉及用一種或多種含有所需基因的桿狀病毒感染 Sf9 昆蟲細(xì)胞。然而，生產(chǎn) rAAV 最常見的選擇是瞬時轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞。該策略于 1998 年首次被描述，利用含有腺病毒輔助基因、rep/cap 基因和目的轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒。與其它生產(chǎn) rAAV 的方法相比，瞬時轉(zhuǎn)染工藝具有快速啟動初始開發(fā)的優(yōu)勢，但成本高昂且難以規(guī)模放大。
瞬時轉(zhuǎn)染涉及一種化學(xué)試劑，將編碼 rAAV 結(jié)構(gòu)和合成基因的 DNA 遞送至 HEK293 細(xì)胞中（圖 1）。這些基因只是暫時表達(dá)，因?yàn)椴《竞椭委熁驔]有整合到 HEK293 基因組中，并且每次生產(chǎn)運(yùn)行都需要轉(zhuǎn)染操作。在引入 DNA 之前，將細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模，通常在三個質(zhì)粒上提供 DNA，其中輔助質(zhì)粒、rep/cap 和轉(zhuǎn)基因在單獨(dú)的構(gòu)建體上，盡管也有文章描述了二質(zhì)粒系統(tǒng)。盡管質(zhì)粒 DNA 通常是生物來源的，但修飾衣殼或質(zhì)粒上的治療性轉(zhuǎn)基因比哺乳動物細(xì)胞系更簡單。
本文將介紹開發(fā)和優(yōu)化在懸浮 HEK293 細(xì)胞中生產(chǎn) rAAV 的上游瞬時轉(zhuǎn)染工藝的最新策略和挑戰(zhàn)。盡管轉(zhuǎn)染工藝最初是針對貼壁 HEK293 細(xì)胞開發(fā)的，但如今大多數(shù)工藝都是基于懸浮的，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。四個主要領(lǐng)域（大致對應(yīng)于該工藝的原材料）對 rAAV 的生產(chǎn)力和質(zhì)量有顯著影響：轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒、細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞系。盡管策略可細(xì)分為這些類別，但它們之間存在相互作用和相互依賴。我們認(rèn)識到，通過生物反應(yīng)器工藝優(yōu)化可以取得重大成果，而更大的挑戰(zhàn)在于工藝放大，但上游轉(zhuǎn)染工藝的這些方面在此不做詳細(xì)討論。
轉(zhuǎn)染試劑
轉(zhuǎn)染過程取決于以有效方式將質(zhì)粒 DNA 遞送至細(xì)胞的能力。機(jī)械遞送方法（例如電轉(zhuǎn)）已經(jīng)開發(fā)出來，但它們通常需要額外的設(shè)備和進(jìn)一步的工藝步驟（例如緩沖液置換）。相反，化學(xué)遞送方法是通過瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn) AAV 的主要選擇。早期技術(shù)利用磷酸鈣沉淀。然而，該方法需要精確的 pH 控制以獲得最佳轉(zhuǎn)染效率，以及轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)基置換以抵消試劑的細(xì)胞毒性。隨著向基于懸浮的工藝的轉(zhuǎn)變，使得細(xì)胞培養(yǎng)操作變得更加可放大，磷酸鈣被取代。在過去的幾十年里，人們開發(fā)出了多種更適合生產(chǎn)的試劑，它們依賴于陽離子試劑和陰離子 DNA 之間的相互作用來進(jìn)入細(xì)胞。這些包括陽離子聚合物（例如聚乙烯亞胺）、陽離子脂質(zhì)基試劑（例如 Lipofectamine）和其它陽離子物質(zhì)（例如 FectoVIR）。
無論使用哪種試劑，轉(zhuǎn)染過程通常涉及將試劑和 DNA 混合，然后進(jìn)行試劑-DNA 復(fù)合物形成的孵育期，然后添加到培養(yǎng)物中。該工藝過程的細(xì)節(jié)由試劑決定，并且經(jīng)常需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。
陽離子聚合物聚乙烯亞胺 (PEI) 是最早用于在懸浮馴化的 HEK293 細(xì)胞中生產(chǎn) AAV 的轉(zhuǎn)染試劑之一，并且至今仍在常規(guī)使用。經(jīng)常使用多種 PEI，因?yàn)樵撛噭┯卸喾N分子量的支鏈或直鏈形式。一種常見的選擇是 PEI MAX，一種來自 Polysciences 的 40 kDa 線性 PEI 。最近發(fā)現(xiàn)，與 PEI MAX 相比，PEIpro (Polyplus-transfection) 和 PEI Prime (Serochem) 產(chǎn)生的 AAV 載體基因組滴度略高。
由于 PEI 是一種廣泛使用的轉(zhuǎn)染試劑，因此對其絡(luò)合和遞送機(jī)制進(jìn)行了研究，并報道了許多圍繞 PEI 轉(zhuǎn)染過程的優(yōu)化。PEI 將 DNA 凝結(jié)成帶正電荷的復(fù)合物，然后通過疏水相互作用聚集。通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，PEI-DNA 復(fù)合物逃離內(nèi)體。雖然確切的機(jī)制尚不清楚，但 PEI 被認(rèn)為可以促進(jìn)解復(fù)合的 DNA 進(jìn)入細(xì)胞核。
圖1 瞬時轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒DNA（黑色圓圈）和轉(zhuǎn)染試劑（藍(lán)色）形成復(fù)合物，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。AAV 衣殼組裝和病毒基因組在細(xì)胞核中包裝后，病毒顆粒（紫色）被分泌到細(xì)胞質(zhì)中。有效載荷可以設(shè)計為 ssDNA 或 scDNA 基因組。
圖 2 通過瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn) AAV 的策略總結(jié)。
雖然 PEI 價格實(shí)惠且作為轉(zhuǎn)染試劑已得到廣泛認(rèn)可，但 PEI-DNA 絡(luò)合的性質(zhì)在更大范圍內(nèi)提出了挑戰(zhàn)。因此，除了提高載體生產(chǎn)力外，最近的試劑開發(fā)還集中在轉(zhuǎn)染可放大性上。2020年，Polyplus-transfection發(fā)布了新型轉(zhuǎn)染試劑FectoVIR-AAV，該試劑是為提高載體生產(chǎn)力和可放大性而開發(fā)的。Polyplus 的轉(zhuǎn)染研究證明，與 PEI MAX 相比，使用 FectoVIR-AAV 的 AAV2 感染滴度增加了十倍，其它人報告，與 PEIpro 和未指明的市場替代品相比，使用 FectoVIR-AAV 的病毒基因組滴度增加了。此外，發(fā)現(xiàn) FectoVIR-AAV-DNA 復(fù)合物可保持穩(wěn)定長達(dá) 6 小時，并且可以濃縮 10 倍，僅占最終培養(yǎng)工作體積的 1%，而不影響載體基因組滴度。較長的孵化時間和較小的體積具有簡化大規(guī)模 AAV 生產(chǎn)工藝的優(yōu)勢。
陽離子脂質(zhì)試劑（例如 Lipofectamine）也已用于瞬時轉(zhuǎn)染。Shi等人報道，用 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染的 HEK293 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率接近 100%。另一種市售轉(zhuǎn)染試劑是 AAV MAX，據(jù)報道，與 PEI MAX 和 PEIpro 相比，其病毒基因組滴度增加了五倍。其它轉(zhuǎn)染試劑，例如 TransIT-VirusGen，包括陽離子脂質(zhì)和聚合物。與其它類別的轉(zhuǎn)染試劑一樣，脂質(zhì)試劑還有很大的優(yōu)化空間。最近，Guan等人合成的陽離子脂質(zhì)體與 PEI MAX 相比，AAV 生產(chǎn)率顯著提高。建議優(yōu)化脂質(zhì)體的大小，以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。
有幾個因素影響 PEI-DNA 復(fù)合物的穩(wěn)定性，包括 PEI 與 DNA 的比例。研究發(fā)現(xiàn)較高量的 PEI 可以穩(wěn)定復(fù)合物，但也與更大的細(xì)胞聚集和細(xì)胞毒性有關(guān)。因此，許多方案使用范圍為 2:1–4:1 的 PEI:DNA 比例。添加鹽（例如 NaCl）也被證明可以提高穩(wěn)定性。此外，PEI-DNA 復(fù)合物的尺寸隨著時間的推移而增加，直徑達(dá)到 3 μm 或更大。因此，許多轉(zhuǎn)染方案僅將 PEI-DNA 溶液孵育 10-15 分鐘，然后將其添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中。由于較短的孵育時間使大規(guī)模生產(chǎn)變得復(fù)雜，因此已經(jīng)提出了幾種控制 PEI-DNA 絡(luò)合的方法。這些措施包括添加表面活性劑、降低 pH 值或溫度或使用粘性共溶劑。Hu等人開發(fā)了一種通過調(diào)節(jié)一系列受限沖擊噴射混合器中的 pH 值和鹽濃度來停止不同粒徑的 PEI-DNA 絡(luò)合的方法。與標(biāo)準(zhǔn)方案相比，該技術(shù)在 2 L 規(guī)模下可產(chǎn)生更高的慢病毒載體感染滴度。此外，PEI-DNA 復(fù)合物在室溫下表現(xiàn)出可穩(wěn)定兩天，在 -80°C 下表現(xiàn)出四個月的穩(wěn)定性，為生產(chǎn)提供了靈活性。
最近，開發(fā)了三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染工藝的機(jī)制模型，描述了質(zhì)粒遞送和 rAAV 生物合成的動力學(xué)。模型實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入細(xì)胞核的瓶頸，以及單鏈 DNA 和衣殼合成的時機(jī)不正確，導(dǎo)致大量的空衣殼。成功靶向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)染試劑的開發(fā)將顯著提高 rAAV 的生產(chǎn)率。
自從采用轉(zhuǎn)染技術(shù)生產(chǎn) AAV 以來，PEI 和替代試劑的許多改進(jìn)已經(jīng)被開發(fā)出來。試劑選擇和絡(luò)合優(yōu)化是提高生產(chǎn)率和可生產(chǎn)性的策略。然而，試劑仍然限制轉(zhuǎn)染效率，并且必須在影響轉(zhuǎn)染的其它變量的背景下考慮試劑和絡(luò)合條件，如下文部分所述。
質(zhì)粒
質(zhì)粒 DNA 是轉(zhuǎn)染工藝的另一個關(guān)鍵組成部分。由于 rAAV 生物合成是在三個獨(dú)立的構(gòu)建體上提供的，因此發(fā)現(xiàn)質(zhì)?？偭恳约跋鄬|(zhì)粒比例可以調(diào)節(jié) rAAV 生產(chǎn)力和質(zhì)量。質(zhì)粒 DNA 的數(shù)量也與轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度有關(guān)。已經(jīng)進(jìn)行了大量研究來優(yōu)化用于 rAAV 生產(chǎn)的細(xì)胞密度、DNA 量和質(zhì)粒比例。
DNA與質(zhì)粒比例
據(jù)報道，總質(zhì)粒 DNA 量約為每 10^6 cells 1.5 μg。研究發(fā)現(xiàn)，較高數(shù)量的 DNA 并沒有提高滴度。此外，質(zhì)粒DNA占生產(chǎn)成本的很大一部分。還有研究探索了每種質(zhì)粒對感染滴度的影響 - 一項表征質(zhì)粒比例的早期研究使用非編碼“填充”質(zhì)粒來獨(dú)立改變?nèi)齻€ rAAV 質(zhì)粒的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)等摩爾比例的輔助質(zhì)粒、rep/cap 和轉(zhuǎn)基因質(zhì)?？僧a(chǎn)生最高的感染滴度。將rep/cap和轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的量各減少至10%，同時將輔助質(zhì)粒的量維持在80%，導(dǎo)致感染滴度僅降低33%。然而，將輔助質(zhì)粒減少至 30% 會導(dǎo)致感染滴度降低十倍以上。這凸顯了輔助基因在載體生產(chǎn)中的重要性。此外，還發(fā)現(xiàn)減少rep/cap量會降低感染滴度。當(dāng)使用質(zhì)粒比例來優(yōu)化rAAV生產(chǎn)力時，發(fā)現(xiàn)較高比例的輔助質(zhì)粒和rep/cap質(zhì)粒增加了載體基因組滴度，報告最佳輔助：rep/cap：轉(zhuǎn)基因摩爾比為2:1.5:1。
原文：A.Bretti, S.Doong, AAV production by transient transfection: strategies & challenges. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(5), 763–776.
