疫苗是預(yù)防和控制傳染病最經(jīng)濟、有效的手段，疫苗接種是通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答來預(yù)防和控制人類和動物疾病的常規(guī)方法。疫苗技術(shù)已經(jīng)從以巴斯德原則的病原體“分離、滅活和注射”發(fā)展到基于基因工程、免疫學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、反向疫苗學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)融合的現(xiàn)代疫苗技術(shù)，正在向著癌癥、自身免疫病和其他慢性疾病等領(lǐng)域拓展。面對當(dāng)今重大、復(fù)雜、突發(fā)、高變病原體，傳統(tǒng)疫苗學(xué)方法難以滿足需求，而且還有部分重大感染性疾病的疫苗品種，如針對HIV、結(jié)核桿菌、瘧原蟲和其他廣泛傳播的病原體的疫苗尚未研發(fā)成功，新型疫苗技術(shù)是應(yīng)對未來全球健康挑戰(zhàn)的有利武器。本文主要梳理了當(dāng)前各類熱點技術(shù)疫苗生產(chǎn)工藝，僅供學(xué)習(xí)參考。重組蛋白疫苗工藝是一種新型的疫苗制備技術(shù)，它利用基因工程技術(shù)將病原體的特定蛋白基因克隆到表達(dá)載體中，通過大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)和純化技術(shù)制備出高純度的蛋白質(zhì)疫苗。相比傳統(tǒng)的滅活疫苗和活疫苗，重組蛋白疫苗具有安全性高、穩(wěn)定性好、易于生產(chǎn)等優(yōu)點，已經(jīng)成為當(dāng)前疫繭研究的熱點之一。重組蛋白疫苗生產(chǎn)主要包含以下幾個流程:1.基因克隆:將病原體的特定蛋白基因克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體。2.細(xì)胞培養(yǎng):將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白。3.蛋白純化:通過離心、層析、電泳等技術(shù)將重組蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)液中純化出來，得到高純度的蛋白質(zhì)疫苗。4.疫苗制備:將純化后的重組蛋白與適當(dāng)?shù)淖魟┗旌?，制備成疫苗?/span>重組蛋白疫苗的制備過程相對復(fù)雜，需要高水平的技術(shù)和設(shè)備支持。但是，相比傳統(tǒng)的滅活疫苗和活疫苗，重組蛋白疫苗具有更好的安全性和穩(wěn)定性，能夠有效預(yù)防多種傳染病，如乙肝、流感、艾滋病等。VLP疫苗生產(chǎn)工藝是- -種新型的疫苗生產(chǎn)技術(shù)，它是利用基因工程技術(shù)將病毒的外殼蛋白表達(dá)出來，形成類似于病毒的顆粒，這些顆粒被稱為病毒樣顆粒(VLP)，它們具有與真正的病毒相同的外形和結(jié)構(gòu)，但是不含有病毒的核酸，因此不會引起疾病。VLP疫苗具有很高的安全性和兔疫原性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)甩于預(yù)防多種傳染病，如乙型肝炎、人乳頭瘤病毒感染等。VLP疫苗的生產(chǎn)工藝主要包括以下幾個流程:1.基因克隆:首先需要將病毒的外殼蛋白基因克隆到表達(dá)載體中，這個過程需要利用PCR技術(shù)擴增目標(biāo)基因，并將其插入到表達(dá)載體中。2.細(xì)胞培養(yǎng):將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，使其表達(dá)外殼蛋白基因，產(chǎn)生VLP顆粒。常用的宿主細(xì)胞包括酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。3.純化和提取:將細(xì)胞培養(yǎng)液進行離心、過濾等操作，將VLP顆粒從細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)中分離出來。常用的純化方法包括超速離心、柱層析、電泳等。4.疫苗制備:將純化后的VLP顆粒進行滅活、加工等處理，制備成疫苗。常用的加工方法包括凍干、混懸液等。如果表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的是單體或多聚體蛋白，使用物理或自動組裝成與天然病毒相似的空心顆粒作為疫苗，這被稱為類病毒顆粒（VLP），如預(yù)防人乳頭瘤病毒的HPV疫苗。目前通常使用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)VLP疫苗，因為疫苗蛋白為胞內(nèi)表達(dá)，完成發(fā)酵收集菌體后，需要將酵母細(xì)胞破碎，使用澄清過濾去除細(xì)胞碎片，經(jīng)過Mustang膜層析捕獲目標(biāo)蛋白，寬泛流速范圍，尖銳洗脫峰優(yōu)勢更加明顯。進一步精純后，超濾換液，進入制劑灌裝環(huán)節(jié)。VLP疫苗典型生產(chǎn)工藝（HPV-酵母表達(dá)）隨著疫苗研制技術(shù)發(fā)展，上述提到的傳統(tǒng)疫苗中的細(xì)菌多糖疫苗，為了提高其免疫效應(yīng)，使用化學(xué)方法將蛋白成份與多糖結(jié)合，制備出多糖結(jié)合疫苗，可增加嬰幼兒對細(xì)菌多糖的免疫效應(yīng)。其工藝主要流程是上游經(jīng)過細(xì)菌發(fā)酵，收集菌體，加入滅活劑進行脫毒處理后，使用深層過濾方法以保證過程的生物符合。使用超濾系統(tǒng)濃縮降低收獲液體積并去除小分子蛋白，經(jīng)過澄清過濾攔截大分子及有形雜質(zhì)后，重復(fù)經(jīng)過超濾和澄清過濾，完成多糖的制備。此時，可以進行多糖疫苗的制劑灌裝。結(jié)合疫苗則進入蛋白結(jié)合步驟，此步驟主要使用化學(xué)方法將蛋白與多糖結(jié)合，過程中除了結(jié)合的目標(biāo)產(chǎn)物外，還會產(chǎn)生游離多糖和蛋白，一般采用超濾和層析方法去除。在制劑灌裝階段使用一次性配液灌裝系統(tǒng)，可以提高批件切換效率，避免不同血清型原液的交叉污染。多糖結(jié)合疫苗由于是通過化學(xué)方法將蛋白與多糖結(jié)合，因此需要對生產(chǎn)/加工后的大分子完整性進行監(jiān)測。貝克曼庫爾特的分析型超速離心技術(shù)（AUC）現(xiàn)在被認(rèn)為是評估分子完整性和聚集體的重要技術(shù)，可以對蛋白質(zhì)和細(xì)菌多糖組成的的大型糖綴合物分子量分布進行檢測，從而分析多糖結(jié)合疫苗的完整性情況。病毒載體疫苗是一種利用病毒疫苗減毒株或非復(fù)制型病毒作為載體，將抗原基因的編碼有效地傳遞到宿主細(xì)胞核并引發(fā)免疫應(yīng)答的疫苗。目前已有多種病毒，如腺病毒、慢病毒、水皰性口炎病毒、皰疹病毒、麻疹病毒和重組牛痘病毒安卡拉株等作為載體用于疫苗的研發(fā)。病毒基因組可以表達(dá)任何特定的抗原，并可穩(wěn)定接受大基因片段的插入，抗原可在宿主中準(zhǔn)確的合成、修飾以及靶向特異細(xì)胞，使得病毒載體技術(shù)可用于多種疫苗開發(fā)。例如，康希諾生物的腺病毒載體新冠疫苗（Ad5-nCoV）是把新冠病毒S蛋白的基因構(gòu)建到腺病毒基因組。外殼仍然是腺病毒的正常外殼蛋白，但里面的基因卻含有編碼新冠病毒S蛋白的基因。因此，腺病毒侵染宿主細(xì)胞的時候，把編碼新冠病毒S蛋白的基因都釋放到宿主細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中合成S蛋白，由S蛋白激發(fā)一系列的免疫反應(yīng)。
滅活疫苗是對病毒或細(xì)菌進行培養(yǎng)后通過物理或化學(xué)方法處理將其滅活從而獲得無感染活性的一類疫苗。相較于減毒疫苗和基因工程疫苗，滅活疫苗具有研發(fā)周期短、制備工藝相對成熟、無感染毒力和安全性高等優(yōu)點。但一般需要多次接種才能產(chǎn)生保護性免疫[2]，通常誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞免疫普遍較弱。目前已在國內(nèi)上市的滅活疫苗包括脊灰滅活疫苗、乙腦滅活疫苗、百日咳-白喉-破傷風(fēng)（百白破）疫苗、流感疫苗和人用狂犬病疫苗等，以及國藥中生和科興生物的新冠滅活疫苗。滅活疫苗平臺相對成熟，安全性高，應(yīng)對新發(fā)病原體響應(yīng)速度快。它的生產(chǎn)工藝流程包括以下幾個流程:1.病原體的培養(yǎng)：滅活疫苗的制作需要先培養(yǎng)病原體。病原體可以是病毒、細(xì)菌或其他微生物。在實驗室中，病原體會被培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，以便它們能夠生長和繁殖。2.病原體的滅活：一旦病原體被培養(yǎng)出來，就需要將其滅活。滅活的方法有多種，包括化學(xué)滅活、熱滅活和輻射滅活等。這些方法都能夠殺死病原體，但不會破壞其抗原性，從而使其仍能夠激發(fā)人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。3.病原體的提取和純化：滅活的病原體需要被提取和純化，以便制成疫苗。這個過程通常涉及到多個步驟，包括離心、過濾、沉淀和洗滌等。這些步驟可以去除病原體中的雜質(zhì)，從而提高疫苗的純度和效力。4.疫苗的配制和包裝：一旦病原體被提取和純化，就需要將其配制成疫苗。這個過程通常涉及到將病原體與適當(dāng)?shù)妮o料混合在一起，以便制成疫苗。這些輔料可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑和緩沖劑等。一.旦疫苗被配制好，就需要將其包裝在適當(dāng)?shù)娜萜髦?，以便運輸和儲存。5.疫苗的質(zhì)量控制：滅活疫苗需要經(jīng)過質(zhì)量控制，以確保其安全和有效。這個過程通常涉及到多個步驟，包括疫苗的理化性質(zhì)測試、微生物學(xué)測試和動物實驗等。只有通過了這些測試，疫苗才能夠被批準(zhǔn)用于人類接種。滅活疫苗的生產(chǎn)工藝流程是一個復(fù) 雜的過程，需要經(jīng)過多個步驟才能夠制成。這些步驟包括病原體的培養(yǎng)、滅活、提取和純化、疫苗的配制和包裝以及疫苗的質(zhì)量控制等。只有通過這些步驟，才能夠制成安全有效的滅活疫苗，用于預(yù)防疾病。DNA疫苗是將編碼抗原蛋白的真核表達(dá)盒插入到細(xì)菌質(zhì)粒中，再由高效的真核啟動子驅(qū)動抗原蛋白的表達(dá)。DNA疫苗可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫、免疫效果持久性強、制備簡單、易大規(guī)模生產(chǎn)，但也存在免疫原性弱、質(zhì)粒DNA遞送效率低和表達(dá)效率低等不足，以及外源基因整合到宿主基因組而導(dǎo)致的突變和生成腫瘤的風(fēng)險。目前進入臨床試驗的DNA疫苗有中東呼吸綜合征疫苗、寨卡病毒疫苗、HIV疫苗、流感疫苗、EBOV疫苗、宮頸癌疫苗GX-188E、B細(xì)胞淋巴瘤疫苗、登革熱疫苗TVDV等，以及11個COVID-19疫苗，其中INO4800編碼SARA-CoV-2全長S蛋白，Ⅰ期臨床研究數(shù)據(jù)顯示該疫苗無嚴(yán)重不良反應(yīng)，能刺激產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。DNA疫苗受限于較弱的免疫應(yīng)答和較大的免疫劑量，以及如何有效遞送，期待未來改進。1．質(zhì)粒庫和三級種子庫的建立:天然質(zhì)粒存在缺陷，不能直接應(yīng)用于實際基因工程。構(gòu)建良好的質(zhì)粒庫和種子庫，可以高效生產(chǎn)特定需求的質(zhì)粒DNA疫苗。2．工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)DNA:疫苗工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)實際上是DNA疫苗生產(chǎn)工藝的重要步驟，培養(yǎng)菌的好壞會在很大程度上決定質(zhì)粒產(chǎn)量。所以需要獲得質(zhì)量較高的菌群，優(yōu)化培養(yǎng)方案。3．裂解菌體: DNA疫苗的生產(chǎn)，需要使用裂解工藝，這就需要進行裂解劑的選擇、裂解工藝的優(yōu)化研究，并進行工藝驗證。在大規(guī)模生產(chǎn)中，不能采用實驗室常用的超聲破碎和高壓勻漿以及堿裂解法等方法。我們需要控制溫和穩(wěn)定的反應(yīng)體系,控制裂解時間在5分鐘以內(nèi)(時間也不宜過短)，裂解pH值范圍為12.0-12.5, 攪拌條件需溫和且可以充分均勻。4．質(zhì)粒DNA的回收：裂解處理完成后，需要對所得液體進行澄清處理。合適的澄清操作可以初步去除細(xì)胞碎片、全細(xì)胞、膠質(zhì)及其他一些較大的聚集物，為下游后續(xù)的工藝減少壓力。在一-定程度上，澄清還可以降低一些不溶性雜質(zhì)、宿主細(xì)胞蛋白及核酸的含量。一般使用離心、過濾工藝實現(xiàn)該流程。有時可分為多個步驟,如先進行初步澄清除去較大雜質(zhì)顆粒,再進行澄清除去膠質(zhì)和較小顆粒。5．質(zhì)粒初步純化:進行裂解完的溶液通常還含有細(xì)胞蛋白(雜蛋白)、培養(yǎng)中引入的雜質(zhì)等物質(zhì)。如果疫苗中含雜質(zhì)量過多，則會引起過敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)。因此，疫苗必須進行純化，去除雜質(zhì)。初步純化可以濾去大部分雜質(zhì)，降低后續(xù)工藝的壓力。我們應(yīng)通過對雜質(zhì)去除率、DNA回收率等的研究選擇不同截留分子量的超濾膜、確定濃縮倍數(shù)。組件的選擇需要根據(jù)當(dāng)次的生產(chǎn)所需(包括需要了解過程流體和CIP (溶出物、吸附、溶脹、脫落，通過VI級) 的化學(xué)和機械穩(wěn)固性、進料通道填塞、殘存/工作體積、傳質(zhì)效率等一系列的參數(shù))，按照過濾組件供應(yīng)商所提供的數(shù)據(jù)選擇，并且需要進行小規(guī)模試驗后(組件需要能可靠線性放大)，確定最終的生產(chǎn)工藝的所需組件規(guī)格與設(shè)定。-般性的工藝流程可如下(注:各操作條件可具有靈活性,實際根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格要與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)，確保性能優(yōu)良)。6．質(zhì)粒高度純化:純化時，需要使電導(dǎo)率、紫外吸收、鹽濃度、pH值均達(dá)到平衡，讓條件溫和穩(wěn)定，一般凝 膠過濾層析配合其他層析方法聯(lián)合使用達(dá)到最佳效果。柱層析和/或密度梯度離心為去除雜質(zhì)的有效步驟，應(yīng)優(yōu)化層析條件，如層析柱類型、上樣量、洗脫液條件等工藝參數(shù)。純化工藝確定后，還要對其進行驗證。通過對各純化步驟對細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)雜質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)(如有機溶劑、核酸內(nèi)切酶、滅活劑、裂解劑等)的去除效果以及對有效成分的分離純化效果的驗證，來評估純化工藝的合理性。同時，還要關(guān)注純化過程中污染的控制，進行中間產(chǎn)物(如超濾液、層析洗脫液等)及微生物限度的檢測，并根據(jù)多批次的生產(chǎn)檢定結(jié)果建立限度標(biāo)準(zhǔn)。7．濃縮、配制、除菌過濾以及分裝等：膜組件(超濾濃縮) :中空纖維膜組件，平板膜包等都可以滿足基本濃縮工藝要求。完成濃縮后，再進行除菌過濾，確保產(chǎn)品的無污染，并根據(jù)要求進行配置分裝。制備工藝是制備成功的關(guān)鍵因素，但是質(zhì)粒庫、種子庫、工程菌發(fā)酵液、疫苗原液和成品的樣品質(zhì)量檢測等質(zhì)量控制體系與保證體系也是在DNA疫苗制備的非常關(guān)鍵的因素。以及對產(chǎn)品的毒性檢測也是值得深入研究的。mRNA疫苗的研發(fā)過程包括選擇目標(biāo)病原體的特異性抗原蛋白，對該蛋白基因進行測序、合成并克隆到DNA模板質(zhì)粒中，在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后接種到受試者體內(nèi)。目前，mRNA疫苗主要包括兩類，傳統(tǒng)的非復(fù)制型mRNA和自我擴增型mRNA。相比于傳統(tǒng)疫苗，mRNA疫苗具有與活病毒類似的免疫應(yīng)答機制、無感染或整合到宿主基因組的風(fēng)險、更穩(wěn)定并能夠高效表達(dá)抗原蛋白、簡單快速的化學(xué)合成制備更容易低成本和大規(guī)模生產(chǎn)。目前研究較多的是自我擴增型RNA（SAM），因為其含有一個α病毒基因組，有完整的編碼RNA復(fù)制機制的相關(guān)基因。以新冠病毒（SARS-CoV-2）mRNA疫苗為例，其生產(chǎn)工藝流程大致如下：1．DNA原液制備：首先需要設(shè)計與構(gòu)建含有S蛋白基因序列的載體，然后通過大腸桿菌放大培養(yǎng)，獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒。2．mRNA原液的制備：獲取的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒線性化{（噬菌體啟動子（T7）-5 UTR-開放閱讀框（ORF）-3 個非翻譯區(qū)（UTR）-polyA}通過體外轉(zhuǎn)錄（IVT）將前mRNA5'端加帽子。后續(xù)需要經(jīng)過一系列的純化，除菌等過程。除去酶、游離核苷酸、殘留 DNA 和外源 RNA 片段，dsRNA, 及反應(yīng)體系中的免疫原性雜質(zhì)。滿足 GMP 生產(chǎn)的質(zhì)量需求。Moderna的mRNA還需要把尿苷替換成假尿苷，以降低免疫原性。3．利用脂質(zhì)微粒進行包封：制備遞送系統(tǒng)，例如基于聚合物或脂質(zhì)的納米顆粒(LNP)，然后使用不同制造商特有的方法將純化的mRNA封裝在其中。由此產(chǎn)生的mRNA/遞送納米顆粒組件經(jīng)過濃縮、緩沖液交換和無菌過濾。然后最終評估并按此順序包裝成袋/瓶作為原料藥。原料藥通常在最終形成（盡管不適用于某些工藝）最終藥物產(chǎn)品填充之前冷凍儲存，在某些情況下隨后還需要進行凍干。
