加速腺相關(guān)病毒 (AAV) 生產(chǎn)的規(guī)模放大是非?？扇〉?，以滿足對(duì)基因療法日益增長的需求。然而，用于 AAV 基因療法的生物工藝的開發(fā)仍然耗時(shí)且具有挑戰(zhàn)性。質(zhì)量源于設(shè)計(jì) (QbD) 方法可確保生物工藝設(shè)計(jì)滿足所需的產(chǎn)品質(zhì)量和安全性?？焖賶毫y試、可開發(fā)性篩選和規(guī)?？s小技術(shù)有可能在 QbD 框架內(nèi)簡化 AAV 產(chǎn)品和生物工藝的開發(fā)。在這里，我們將回顧它們?cè)诳贵w生產(chǎn)開發(fā)中的成功應(yīng)用如何轉(zhuǎn)化至 AAV，以及這將如何在很大程度上取決于改進(jìn)的分析方法和工具的適應(yīng)性，因?yàn)槿藗儗?duì)成功的療法開發(fā)所需的 AAV 關(guān)鍵屬性有了更多的了解。
基于 AAV 的基因療法的迅速崛起
先進(jìn)療法的快速開發(fā)為腫瘤和罕見病的治療提供了新的可能性。其中，基因療法最近在臨床上取得了成功，顯示出了特別的前景。基因療法的治療效果是通過操縱基因序列或遞送遺傳物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，迄今為止，已針對(duì)多種疾病進(jìn)行了開發(fā)，包括自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜疾病和各種類型的腫瘤。一些現(xiàn)已獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，代表了基因治療發(fā)展的重要新里程碑。圖 1 所示的時(shí)間表總結(jié)了部分已批準(zhǔn)療法的發(fā)展。
圖 1. 截至2019年細(xì)胞和基因治療批準(zhǔn)的時(shí)間表及其目標(biāo)適應(yīng)癥（基因治療，黑色；基于細(xì)胞的基因治療產(chǎn)品，藍(lán)色）。
遺傳物質(zhì)的遞送通常需要將它們摻入病毒或非病毒基因遞送載體中，例如脂質(zhì)納米顆粒、腺病毒或 AAV。本文重點(diǎn)關(guān)注 AAV（圖 2A），它是細(xì)小病毒家族的一員，也是一種廣泛用于基因治療和疫苗的病毒載體，因?yàn)樗哂袕V泛的細(xì)胞嗜性和低免疫原性。野生型 AAV 的基因組包含三個(gè)基因，rep、cap 和 aap（圖 2B），分別編碼關(guān)鍵病毒復(fù)制蛋白、衣殼蛋白（VP1、VP2 和 VP3）和組裝激活蛋白。
圖 2. 腺相關(guān)病毒 (AAV) 血清型 2 的結(jié)構(gòu)和基因組。
迄今為止，已在人類（AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6 和 AAV9）和非人靈長類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了 150 多種 AAV 基因型和 13 種血清型，而在其它物種中發(fā)現(xiàn)了更多。它們?cè)诩?xì)胞嗜性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率方面有所不同，從而導(dǎo)致不同的功能。
必須修改 AAV 基因組、以使其適合臨床應(yīng)用。野生型 AAV 可以整合到宿主基因組中，產(chǎn)生永久性和潛在可遺傳的基因修飾，這會(huì)給患者帶來重大風(fēng)險(xiǎn)。這些風(fēng)險(xiǎn)已在臨床使用的重組 AAV (rAAV) 中消除，方法是用目的治療基因替換 rep 和 cap 基因中的一個(gè)或兩個(gè)，并將移除的基因置于僅在 AAV 生產(chǎn)期間使用的單獨(dú)質(zhì)粒上。因此，新的 AAV 顆粒仍然具有感染性，但無法將完整的 AAV 基因組插入人類宿主染色體，并且無法在“野外”或注射到人體后進(jìn)行復(fù)制。
本文將概述如何使用 QbD、縮小規(guī)模、超縮小規(guī)模 (USD) 和壓力測試等各種工具來加速 AAV 生物工藝的開發(fā)。我們還將總結(jié)當(dāng)前可用于 AAV 表征和生物工藝質(zhì)量控制的分析工具面臨的挑戰(zhàn)。
加速生物工藝開發(fā)的工具
隨著臨床管線的擴(kuò)大，對(duì) AAV 的需求正在迅速增長，這使得對(duì)平臺(tái)化大規(guī)模 AAV 生產(chǎn)工藝的需求比以往任何時(shí)候都更加迫切。它們的生產(chǎn)很復(fù)雜，需要細(xì)胞擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)、病毒收獲以及多個(gè)純化和緩沖液置換步驟。由于 AAV 固有的不穩(wěn)定性和復(fù)雜的生物學(xué)特性，以及能夠告知要實(shí)現(xiàn)的理想產(chǎn)品屬性的長期臨床數(shù)據(jù)相對(duì)較少，因此開發(fā)和放大 AAV 生產(chǎn)工藝非常耗時(shí)且具有風(fēng)險(xiǎn)。它們的開發(fā)還建立在相對(duì)較少的先例之上，并且缺乏 AAV 特異性生物工藝、細(xì)胞系和分析儀器的技術(shù)成熟度優(yōu)勢，而這些優(yōu)勢在更成熟的平臺(tái)（如抗體）中已基本建立。隨著進(jìn)一步的開發(fā)工作提高了單個(gè) AAV 生產(chǎn)步驟的工藝強(qiáng)度，這些挑戰(zhàn)將繼續(xù)演變多年。
預(yù)計(jì)有幾種實(shí)驗(yàn)工具能夠加速 AAV 產(chǎn)品制劑和早期工藝開發(fā)。這些建立在它們?cè)趩慰寺】贵w (mAb) 開發(fā)方面取得的公認(rèn)成功的基礎(chǔ)上，并且按大致的實(shí)施順序可包括：(i) 候選產(chǎn)品的可開發(fā)性篩選；(ii) 用于快速生物工藝開發(fā)的縮小和超縮小工具；(iii) 用于快速制劑的加速（強(qiáng)制）降解篩選。
這些工具中的每一個(gè)都被設(shè)計(jì)為在各自的開發(fā)階段使用，以加速可生產(chǎn)產(chǎn)品候選物的選擇，優(yōu)化生產(chǎn)過程，或用于快速開發(fā)穩(wěn)定的劑量配方。因此，可以提高效率，例如，通過設(shè)計(jì)可開發(fā)性篩選來生成生物物理數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可以更好地為最終產(chǎn)品制劑和保持穩(wěn)定產(chǎn)品的生物工藝參數(shù)操作窗口提供信息。mAb 的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和制劑逐漸集中在一些穩(wěn)健的平臺(tái)方法上。這進(jìn)一步限制了條件的搜索空間，并導(dǎo)致在用于這三種工具的許多實(shí)驗(yàn)條件中出現(xiàn)更大的重疊。相比之下，AAV 的平臺(tái)生產(chǎn)方法還沒有足夠的時(shí)間來完全開發(fā)，因此，使用這三種工具測試的條件也在不斷發(fā)展。
有助于塑造用于加速 mAb 開發(fā)的工具的另一個(gè)特征是 QbD。通過了解工藝參數(shù)如何影響產(chǎn)品特性并最終影響其臨床性能，行業(yè)鼓勵(lì)采用這種方法來降低生物制品生產(chǎn)工藝開發(fā)和規(guī)模放大的風(fēng)險(xiǎn)。如圖 3 所示，該方法將關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 定義為易于測量的生物物理和物理化學(xué)產(chǎn)品特性，以確保達(dá)到質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況 (QTPP) 中定義的所需臨床性能；關(guān)鍵材料屬性 (CMA) 和關(guān)鍵工藝參數(shù) (CPP) 被確定為可能會(huì)顯著影響 CQA 的因素，如果它們發(fā)生變化。因此，前面定義的三個(gè)實(shí)驗(yàn)工具有可能識(shí)別 CMA 和 CPP，甚至量化它們的邊界。
圖 3. 質(zhì)量源于設(shè)計(jì) (QbD) 框架的工作流程。
mAb 的平臺(tái)生產(chǎn)方法和來自許多產(chǎn)品的大量臨床數(shù)據(jù)意味著現(xiàn)在可以相對(duì)快速地定義它們的 CQA。相比之下，隨著更多產(chǎn)品生成臨床數(shù)據(jù)，AAV 的 CQA 可能會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大。這也可能導(dǎo)致使用此處描述的三種工具進(jìn)行測試和測量的條件范圍發(fā)生變化。
用于 AAV 生產(chǎn)生物工藝開發(fā)的規(guī)模縮小和超縮小工具
規(guī)?？s小的平臺(tái)使用與中試到大規(guī)模生產(chǎn)相同的工藝單元操作，并通過足夠嚴(yán)格的控制來實(shí)現(xiàn)高可再現(xiàn)性，但操作體積要小得多，通?？梢圆⑿羞\(yùn)行，以快速探索和優(yōu)化工藝變量。生產(chǎn)工藝的早期中試規(guī)模優(yōu)化可在很大程度上提示 CMA 和 CPP 的可接受設(shè)計(jì)空間以及將它們維持在設(shè)計(jì)空間中的潛在控制策略。因此，可以將規(guī)?？s小的平臺(tái)擴(kuò)展到對(duì)生物工藝操作參數(shù)的更廣泛探索，從而提供更深入的了解。
這種方法現(xiàn)在已經(jīng)很好地用于 mAb 生物工藝開發(fā)，盡管產(chǎn)品之間也存在顯著差異，但某些方面可以很容易地轉(zhuǎn)移到 AAV 中。例如，ambr（Sartorius）等小型化生物反應(yīng)器可以提供與大型生物反應(yīng)器相當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)性能、環(huán)境控制性能和抗體生產(chǎn)率，使其適合作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)/發(fā)酵的預(yù)測工具。使用 24 孔板的縮小方法已被用于優(yōu)化懸浮培養(yǎng)中慢病毒載體的生產(chǎn)，因此具有成功生產(chǎn) AAV 的良好潛力。
其它強(qiáng)大的規(guī)?？s小的系統(tǒng)，如微型層析柱和微升批次孵育，也被廣泛用作層析條件和填料選擇的高通量篩選方法。這些規(guī)?？s小的平臺(tái)已經(jīng)在抗體領(lǐng)域建立了良好的基礎(chǔ)，并且已經(jīng)被用于加速 AAV 生物工藝的開發(fā)。當(dāng)然，AAV 的具體篩選條件會(huì)有所不同，甚至可能在血清型之間也會(huì)有所不同，如 AAV 陰離子交換層析的洗脫電導(dǎo)率和 pH 值等 CPP會(huì)影響空-完整衣殼分離性能。
與規(guī)模縮小相比，超縮小（USD）工具不會(huì)復(fù)制小規(guī)模操作的工藝，而是旨在僅使用毫升樣品、精確模擬大規(guī)模工藝操作單元中遇到的臨界條件。它們可用于優(yōu)化產(chǎn)品、溶液條件或生物工藝參數(shù)，并為每個(gè)操作單元定義 CPP 設(shè)計(jì)空間。特別是，它們可以提供 CPP 對(duì)產(chǎn)品 CQA 影響的因果理解，這對(duì)于 QbD 框架至關(guān)重要。
灌裝/完成和超濾/洗濾 (UF/DF) 步驟通常被發(fā)現(xiàn)是功能性 AAV 滴度損失的主要原因，因此 USD 可能用于確定這些損失的原因。這種損失被認(rèn)為源于濃縮步驟中剪切誘導(dǎo)的病毒聚集。然而，雖然 UF/DF 和灌裝/完成步驟因泵和閥門中的微空化，是生物工藝中剪切應(yīng)力的兩個(gè)主要來源，但需要進(jìn)一步研究，以確認(rèn)剪切應(yīng)力是 AAV 損失的主要原因。治療性蛋白質(zhì)就是這種情況，其中聚集不僅歸因于剪切應(yīng)力，還在于暴露于氣-液界面或在層析純化步驟期間吸附到固體表面相結(jié)合，或者通過泵和閥門中的高剪切率引起的空化現(xiàn)象。此外，發(fā)現(xiàn)溶液的 pH 值和固-液界面的固體表面粗糙度會(huì)影響剪切應(yīng)力下蛋白質(zhì)聚集的程度。
最近的一項(xiàng)USD研究描述了 UF/DF 期間蛋白質(zhì)濃度、剪切速率和跨膜壓力對(duì)濾液通量和 mAb 聚集的影響。與中試規(guī)模過濾實(shí)驗(yàn)的比較表明，測試條件與濾液通量之間存在類似的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)增加的過濾時(shí)間和產(chǎn)品濃度與 USD 和中試規(guī)模 UF/DF 模型中的濁度增加相關(guān)，表明提高蛋白質(zhì)濃度導(dǎo)致更頻繁的蛋白質(zhì)碰撞、更高的聚集傾向以及相應(yīng)更高的濁度。盡管兩個(gè)模型中的濾液通量之間有很好的一致性，但兩個(gè)模型之間剪切暴露程度的差異導(dǎo)致檢測到的濁度存在輕微差異。因此，需要進(jìn)一步修改，以使 USD 更準(zhǔn)確地模擬 UF/DF 中剪切應(yīng)力的影響。在另一項(xiàng)研究中，USD 模型準(zhǔn)確預(yù)測了離心過程中剪切應(yīng)力對(duì)質(zhì)粒 DNA 的影響。
迄今為止，USD 模型已經(jīng)成功地模擬了許多生物制品的大規(guī)模生物工藝條件，包括質(zhì)粒 DNA、單克隆抗體、腺病毒和細(xì)胞。然而，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道使用 USD 模型來預(yù)測 AAV 在剪切應(yīng)力下的行為。
原文：Z.Jiang, P.A.Dalby, Challenges in scaling up AAV-based gene therapy manufacturing. Trends in Biotechnology, 2023.
