質(zhì)粒作為生物藥物
近年來基因和細(xì)胞治療行業(yè)的快速增長極大地增加了對質(zhì)粒 DNA 的需求。質(zhì)粒用于將編碼治療性蛋白質(zhì)、RNA 或抗原的遺傳信息或基因直接遞送至患者的靶細(xì)胞（圖 1A和表 1)。此外，質(zhì)粒還用作載體來遞送基因編輯系統(tǒng)的分子組件（例如，編輯酶、RNA向?qū)В?，包括成簇?guī)則間隔的短回文重復(fù)DNA序列（CRISPR）、鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)核酸酶 (TALEN)。在此類體內(nèi)用途中，適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒與其它成分（例如佐劑、脂質(zhì)等）組合以產(chǎn)生遞送給患者的醫(yī)藥產(chǎn)品。在這些應(yīng)用中，質(zhì)粒是生物療法，必須在現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范 (cGMP) 下生產(chǎn)，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋O(jiān)管、檢測和控制。
質(zhì)粒作為起始材料
除了作為生物制品的作用外，質(zhì)粒在工程細(xì)胞產(chǎn)品（圖 1Bi 和表 1）或其它生物制品（圖 1Bii 和表 1）的生產(chǎn)中還作為復(fù)雜的起始材料發(fā)揮著支持作用。例如，在嵌合抗原受體 T 細(xì)胞 (CAR-T) 療法、基因組編輯方法或間充質(zhì)干細(xì)胞療法的背景下，質(zhì)粒被用作病毒載體的替代品，對從患者或捐獻(xiàn)者體內(nèi)提取的細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。第一個情況需要用質(zhì)粒系統(tǒng)（例如編碼CAR基因、轉(zhuǎn)座酶等）轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，目的是實(shí)現(xiàn)CAR的穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)移、整合和表達(dá)。在第二種情況下，質(zhì)粒用于遞送 CRISPR、TALEN 或 ZFN 等基因編輯器的分子組件。無論哪種情況，質(zhì)粒修飾的細(xì)胞都會被輸回患者體內(nèi)。最后，質(zhì)粒還用于修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，例如增強(qiáng)其體內(nèi)治療功能。
病毒載體和 mRNA 的生產(chǎn)也需要質(zhì)粒，它們可以單獨(dú)用作生物制品（圖 1Bii），也可以用作患者細(xì)胞離體修飾的試劑（圖 1C 和表 1）。例如，許多腺相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒（LV）載體是通過使用多個質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞（例如人胚腎（HEK）293T細(xì)胞）來產(chǎn)生的。舉個例子，AAV 顆粒的生產(chǎn)依賴于使用三種不同的質(zhì)粒：一種 AAV 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其兩側(cè)帶有兩個反向末端重復(fù)序列 (ITR) 的目的基因；一種含有 AAV 基因的質(zhì)粒；以及一種編碼腺病毒輔助基因的輔助質(zhì)粒。同樣，通過細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染來生產(chǎn) LV 也需要使用三個或四個不同的質(zhì)粒。然后可以將所得病毒載體施用于患者或用于離體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
圖1 質(zhì)粒DNA在基因和細(xì)胞治療中的直接和間接應(yīng)用。質(zhì)?？捎米?(A) 生物藥物，例如作為 DNA 疫苗或作為體內(nèi)非病毒基因治療/編輯平臺的組成部分，或作為 (B) 起始材料，如 (Bi) 細(xì)胞離體基因工程的起始材料（CAR-T 細(xì)胞、CRISPR 編輯的細(xì)胞等）或用于 (Bii) 病毒載體、mRNA 以及最終 RNA 生物制品的生產(chǎn)。后者可以單獨(dú)用作生物制品 (Bii)，或 (C) 作為患者細(xì)胞離體修飾的起始材料。
圖2 制備質(zhì)粒作為生產(chǎn)工程細(xì)胞產(chǎn)品和病毒載體的起始材料。以淺紅色突出顯示的生產(chǎn)活動應(yīng)遵循 cGMP 原則，而以深紅色突出顯示的生產(chǎn)活動應(yīng)遵守完整的 cGMP。
新冠病毒危機(jī)引發(fā)的mRNA疫苗的出現(xiàn)，也為質(zhì)粒創(chuàng)造了新的用途和激增的需求。在 mRNA 技術(shù)背景下，質(zhì)粒被廣泛用于生產(chǎn) mRNA 的體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 反應(yīng)所需的模板。此類模板通常是通過純化質(zhì)粒的酶線性化或使用 PCR 擴(kuò)增該質(zhì)粒中的目的區(qū)域來產(chǎn)生的。IVT 產(chǎn)生的 mRNA 產(chǎn)品隨后被進(jìn)一步處理和純化，直到可以轉(zhuǎn)移給患者的階段，例如在 mRNA 疫苗接種或基因組編輯的背景下（圖 1Bii 和表 1）。此外，mRNA 產(chǎn)品可用于離體修飾或編輯細(xì)胞（圖 1C 和表 1）。
人們還可以預(yù)見，質(zhì)粒和 IVT 策略可能會在小 RNA 分子的生產(chǎn)中發(fā)揮更重要的作用，例如反義寡核苷酸、RNA 向?qū)Щ?siRNA 產(chǎn)品中使用的雙鏈 RNA。目前，固相化學(xué)合成可以生成長度長達(dá) 50-100 nt 的 RNA，由于其成本效益、自動化方案和非常短的合成周期，是大多數(shù)寡核苷酸藥物合成的首選方法。盡管如此，IVT 廣泛用于合成 RNA 分子以進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究和基礎(chǔ) RNA 生物學(xué)（例如剪接、核糖開關(guān)、CRISPR、lncRNA）研究，在這種情況下，其可能成為一個有吸引力的替代方案。如果這一切實(shí)現(xiàn)，質(zhì)粒很可能在小 RNA 生產(chǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，就像它們在 mRNA 疫苗、治療藥物和試劑中一樣。
質(zhì)粒級別
間接使用質(zhì)粒 DNA 作為病毒載體或 mRNA 疫苗生產(chǎn)的起始材料需要生產(chǎn)大量材料。例如，需要超過1 kg的質(zhì)粒 DNA 才能提供 10 億劑 mRNA 疫苗。由于質(zhì)粒不會出現(xiàn)在直接給予患者的最終藥品中，而是用作其它起始物料、生物藥物或細(xì)胞產(chǎn)品的 cGMP 生產(chǎn)的起始材料，因此不嚴(yán)格要求 cGMP 等級。然而，盡管并非所有 GMP 方面或 GMP 證書都是必需的，但在生產(chǎn)過程中仍應(yīng)遵守 GMP 原則，因?yàn)槠鹗荚献罱K可能會在藥品成品中殘留，并可能影響其質(zhì)量、安全性和功效。最終，開發(fā)商需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險分析，以確定適合在 cGMP 下進(jìn)一步生產(chǎn)藥品的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。需要適當(dāng)考慮的相關(guān)方面包括質(zhì)量管理體系、文件、原材料、細(xì)胞庫、生產(chǎn)、規(guī)格、檢測、控制和儲存等。因此，人們可以選擇生產(chǎn)一種 cGMP-like/高質(zhì)量的質(zhì)粒 DNA，雖然不符合所有 cGMP 要求，但仍然符合許多監(jiān)管建議。圖2 強(qiáng)調(diào)了依賴于質(zhì)粒起始材料的工程細(xì)胞產(chǎn)品和病毒載體的生產(chǎn)階段，其中應(yīng)采用 cGMP 和 cGMP 原則。
大規(guī)模質(zhì)粒生產(chǎn)
盡管已經(jīng)相當(dāng)成熟，但大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒 DNA 并非易事，生產(chǎn)商不斷地被迫尋找在不影響質(zhì)量的情況下提高生產(chǎn)率的方法。這種提高生產(chǎn)性能的壓力部分源于這樣一個事實(shí)：可用產(chǎn)能不足以及時響應(yīng)與不斷增長的質(zhì)粒應(yīng)用的開發(fā)相關(guān)的需求增長。
目前，質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)僅依賴于一種平臺宿主 - 大腸桿菌。這種偏好的合理性在于大腸桿菌能夠在一系列條件下快速生長和分裂并提供高質(zhì)粒 DNA 產(chǎn)量。此外，還有許多工具可支持大腸桿菌的分子和微生物工程，包括創(chuàng)建質(zhì)粒載體和改良菌株。大腸桿菌的改良菌株可以生長到每升數(shù)百克的密度，每升培養(yǎng)物可產(chǎn)生高達(dá) 1-2 g 的質(zhì)粒 DNA。人們還致力于開發(fā)改良的大腸桿菌菌株，這些菌株可以避免不穩(wěn)定問題，例如處理含有 ITR 的質(zhì)粒（例如在 AAV 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒生產(chǎn)過程中使用的質(zhì)粒）時所面臨的不穩(wěn)定問題。
提高生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的質(zhì)粒數(shù)量、簡化監(jiān)管審批并改善質(zhì)粒生物學(xué)功能的一種方法是專注于 DNA 主鏈的工程設(shè)計。人們一直致力于生成更小、不含抗生素抗性基因、提高產(chǎn)量并提供高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的質(zhì)粒和質(zhì)粒系統(tǒng)（例如，微環(huán)、納米質(zhì)粒、微載體）。
從發(fā)酵結(jié)束時回收的大腸桿菌生物質(zhì)中分離和純化質(zhì)粒是一項工程挑戰(zhàn)，但大部分已得到解決，特別是在較小規(guī)模的情況下。質(zhì)粒下游工藝中使用的一系列單元操作幾乎不可避免地包括堿裂解、切向流過濾和層析步驟。使用不同的操作組合來處理具有殘留量宿主雜質(zhì)（基因組 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂多糖等）的質(zhì)粒 DNA，且符合監(jiān)管要求。
尚未得到滿意解決的關(guān)鍵問題包括堿裂解的重現(xiàn)性差、層析中缺乏載量和亞型選擇性以及工藝過程中由于剪切導(dǎo)致的超螺旋亞型損失。當(dāng)處理非常大的質(zhì)粒時，使用 0.22 μm 過濾器進(jìn)行最終的除菌過濾也可能很麻煩。
一旦生產(chǎn)出來，應(yīng)嚴(yán)格表征從每批獲得的大量純化質(zhì)粒。用作起始材料的質(zhì)粒的放行規(guī)格基本上將重點(diǎn)關(guān)注與生產(chǎn)作為生物藥物的質(zhì)粒時所涵蓋的屬性相同的屬性。這意味著必須制定同一性（例如序列、同質(zhì)性）、效力（例如濃度、同質(zhì)性）和純度（例如宿主雜質(zhì)、生物負(fù)荷、殘留卡那霉素）的測定以及相應(yīng)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。
總結(jié)
大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒的需求在過去幾年中激增，不僅是因?yàn)橘|(zhì)粒生物藥物（例如用于 DNA 疫苗接種、體內(nèi)基因治療和基因編輯的藥物）的發(fā)展，而且主要是因?yàn)樗鼈冊谀壳霸S多基因和細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)中的支持作用，包括病毒載體、病毒載體疫苗、mRNA疫苗、微環(huán)/微載體/納米質(zhì)粒和工程細(xì)胞。
除了目前的用途之外，可以預(yù)見的是，質(zhì)粒可能會在 IVT 生產(chǎn)小 RNA 分子（例如反義寡核苷酸、RNA 向?qū)?、siRNA 產(chǎn)品）中發(fā)揮重要作用。雖然一開始人們可能會質(zhì)疑 IVT 是否能夠與成熟的寡核苷酸化學(xué)合成相競爭，但朝這一方向發(fā)展的一個驅(qū)動因素可能來自一個意想不到的領(lǐng)域：農(nóng)業(yè)。具體來說，基于通過 RNAi 在植物病原體和其它害蟲中誘導(dǎo)基因沉默的新型農(nóng)藥工具的開發(fā)正在推動開發(fā)具有成本效益的方法來大量生產(chǎn)大量 dsRNA。鑒于化學(xué)合成很可能不適合實(shí)現(xiàn) siRNA 所需的大規(guī)模和低成本生產(chǎn)，IVT 正在成為這種情況下的替代方案。
展望質(zhì)粒生產(chǎn)方面，可以預(yù)見一些發(fā)展將促進(jìn)或完全改變當(dāng)今質(zhì)粒的生產(chǎn)方式。例如，雖然目前大腸桿菌作為質(zhì)粒生產(chǎn)宿主的表現(xiàn)看起來是無與倫比的，但人們可能會想，對質(zhì)粒的高需求是否能證明尋找一種具有更適合生產(chǎn)特征的細(xì)菌宿主是合理的。革蘭氏陽性菌作為質(zhì)粒生產(chǎn)宿主是有利的，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈χ嗵牵嗵鞘菑拇竽c桿菌中分離質(zhì)粒時最麻煩的雜質(zhì)之一。正如重組蛋白生產(chǎn)中出現(xiàn)了大腸桿菌以外的生產(chǎn)宿主一樣，可能還有其它宿主等待被發(fā)現(xiàn)并發(fā)展成質(zhì)粒生產(chǎn)者。
質(zhì)粒主鏈的工程也可能對該領(lǐng)域產(chǎn)生影響。此外，人們應(yīng)該關(guān)注激進(jìn)的創(chuàng)新，例如使用最小的合成結(jié)構(gòu)，例如“狗骨”和啞鈴形 DNA 載體，它們是通過酶法生產(chǎn)的。然而，盡管這些代表了該領(lǐng)域的重要進(jìn)步，但質(zhì)粒在未來被淘汰的可能性很小。此外，小環(huán)、微載體和其它最小化載體的生產(chǎn)仍然依賴于質(zhì)粒。
一次性技術(shù)、過程分析技術(shù)、自動化、數(shù)字化和連續(xù)生產(chǎn)是可能改變未來質(zhì)粒生產(chǎn)方式的行業(yè)趨勢。例如，在后一種情況下，設(shè)計穩(wěn)健且能夠持續(xù)遞送完整質(zhì)粒的連續(xù)細(xì)胞裂解過程是另一個需要尋求的進(jìn)步。
總之，質(zhì)粒目前在許多基因和細(xì)胞治療產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)中發(fā)揮的核心作用，充分證明了為提高其有效性和生產(chǎn)而大幅增加研發(fā)努力和投資的合理性。
原文：D.Prazeres, The supporting role of plasmids in gene & cell therapy. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(5), 755–762.
