在過去十年中，單克隆抗體 (mAb) 作為治療各種疾病的高效、靈活的工具獲得了巨大的治療應(yīng)用。盡管取得了這一成功，但仍有機(jī)會通過優(yōu)化成本效益措施，降低基于抗體的療法的生產(chǎn)成本。為了降低生產(chǎn)成本，在過去幾年中實施了基于最先進(jìn)的補(bǔ)料分批和灌流的新型工藝強(qiáng)化方法。在工藝強(qiáng)化的基礎(chǔ)上，我們在這里介紹一種新穎、創(chuàng)新的混合工藝的可行性和好處，該工藝結(jié)合了補(bǔ)料分批操作的穩(wěn)健性和通過流化床離心機(jī) (FBC) 實現(xiàn)的完整培養(yǎng)基置換的好處。在最初的小規(guī)模 FBC 模擬篩選中，我們研究了多個工藝參數(shù)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖提高和活性趨勢延長。隨后，最高產(chǎn)的工藝方案被轉(zhuǎn)移到 5 L規(guī)模，進(jìn)一步優(yōu)化并與標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批工藝進(jìn)行比較。我們的數(shù)據(jù)表明，在使用與標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批操作相同的反應(yīng)器尺寸和工藝持續(xù)時間的同時，新型混合工藝可顯著提高峰值細(xì)胞密度 (163%) 并將 mAb 量顯著增加約 254%。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示了工藝之間具有可比的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA)，并揭示了規(guī)模放大的可能性，并且無需進(jìn)行廣泛的額外工藝監(jiān)控。因此，這種新的工藝強(qiáng)化策略具有轉(zhuǎn)移到未來工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中的巨大潛力。
簡介
重組表達(dá)的生物治療藥物，如單克隆抗體 (mAb)、激素、細(xì)胞因子和疫苗，近年來在制藥行業(yè)受到極大關(guān)注。特別是，自 1986 年首次獲得臨床批準(zhǔn)（Orthoclone OKT3?）以來，基于 mAb 的新型療法已成為臨床應(yīng)用和生物生產(chǎn)的主要興趣點。從那時起，無數(shù)的臨床試驗凸顯了這些生物治療藥物的獨特優(yōu)勢，例如靈活調(diào)整應(yīng)用、低毒性、高特異性和合適的體內(nèi)半衰期。因此，截至今天，超過 100 種基于 mAb 的治療藥物已獲得美國食品和藥物管理局 (FDA) 的批準(zhǔn)，還有更多藥物正在臨床開發(fā)中，證明人們對這些生物藥物的興趣仍在增加。
治療性抗體的特點是復(fù)雜的翻譯后修飾，以確保蛋白質(zhì)的生物活性和低毒性。因此，哺乳動物細(xì)胞系，如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞，被用于表達(dá)這些復(fù)雜的生物分子，而不是微生物宿主。與小分子療法相比，基于抗體的免疫療法生產(chǎn)成本相當(dāng)高，導(dǎo)致其價格非常昂貴。為了降低成本，新穎的創(chuàng)新強(qiáng)化策略是必要的。
補(bǔ)料分批 (FB) 等不連續(xù)工藝形式因其穩(wěn)健性、簡單性和可重復(fù)性而成為大規(guī)模生產(chǎn) mAb 的最先進(jìn)技術(shù)。該工藝過程可分為三個連續(xù)的培養(yǎng)階段：細(xì)胞呈指數(shù)增長的對數(shù)期、細(xì)胞無生長的穩(wěn)定期和通常由于凋亡細(xì)胞數(shù)量增加而導(dǎo)致細(xì)胞活性下降的死亡期。在防止?fàn)I養(yǎng)限制的 FB 工藝中，這些不同階段之間的過渡通常由抑制分子（如生長抑制劑、副產(chǎn)物和裂解細(xì)胞碎片）的積累觸發(fā)，最終限制了該類工藝的整體生產(chǎn)力和時間跨度。自 1990 年以來，不連續(xù)形式的產(chǎn)品滴度從 0.1 g/L 提高到 5 g/L，主要是通過優(yōu)化細(xì)胞系、培養(yǎng)基系統(tǒng)、過程控制以及從批次模式切換到 FB 模式。此外，已經(jīng)開發(fā)了不同的策略來提高細(xì)胞的生產(chǎn)力，例如添加特定分子來提高生產(chǎn)力、增加滲透壓，以及在穩(wěn)定期改變溫度或 pH 值，從而使細(xì)胞活性和生產(chǎn)力能夠持續(xù)很長一段時間。然而，不連續(xù)操作的關(guān)鍵限制是細(xì)胞源性抑制分子的積累以及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)限制，這限制了該工藝的單位體積生產(chǎn)率。
為了繞過不連續(xù)工藝形式的不利特征，已經(jīng)在不間斷的培養(yǎng)基置換的基礎(chǔ)上尋求替代工藝策略。這些灌流細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過置換培養(yǎng)基使細(xì)胞進(jìn)一步增殖，從而去除抑制性分子并提供新鮮營養(yǎng)素。為了不斷去除無細(xì)胞培養(yǎng)基部分，開發(fā)了細(xì)胞截留裝置，最常見的系統(tǒng)基于交替式切向流 (ATF) 或切向流過濾 (TFF)。通過使用廢棄（bleeding）系統(tǒng)來調(diào)節(jié)活細(xì)胞濃度，可以達(dá)到偽穩(wěn)態(tài)，以防止?fàn)I養(yǎng)限制和細(xì)胞源性分子的濃度，從而允許連續(xù)培養(yǎng)。因此，與不連續(xù)工藝相比，灌流細(xì)胞培養(yǎng)能夠提高單位體積生產(chǎn)率和設(shè)施利用率。然而，這些連續(xù)培養(yǎng)需要大量的培養(yǎng)基 - 每天多達(dá)幾個反應(yīng)器體積 - 用于細(xì)胞截留的大型膜裝置，以及復(fù)雜的過程監(jiān)測。這種增加的培養(yǎng)基消耗是灌流工藝中的主要成本驅(qū)動因素之一。
所有這些混合工藝都利用過濾系統(tǒng)來連續(xù)置換反應(yīng)器中的廢培養(yǎng)基。但是，過濾系統(tǒng)顯示出明顯的缺點，例如置換速度慢，這會導(dǎo)致新供應(yīng)培養(yǎng)基的反向混合以及膜堵塞和污染。該領(lǐng)域的一項新興技術(shù)是流化床離心機(jī) (FBC)，它可以從上清液中快速無菌分離細(xì)胞，并在溫和的工藝條件下進(jìn)行洗滌和濃縮。 FBC 的功能原理依賴于抵消離心力和流動力而產(chǎn)生的細(xì)胞捕獲，而低分子量顆粒，如廢培養(yǎng)基和 mAb，可以流過。該系統(tǒng)最初是作為細(xì)胞澄清設(shè)備開發(fā)的，顯示出 mAb 和細(xì)胞的高回收率。然而，細(xì)胞和培養(yǎng)基的非侵入性 FBC 分離也被假定在上游工藝過程中適用，以允許完整的培養(yǎng)基置換中間工藝。 10 多年前就提出了將洗滌后的細(xì)胞返回細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的一般概念，而其中一個概念包括兩個并行運行的生物反應(yīng)器，其中細(xì)胞培養(yǎng)液通過 FBC 系統(tǒng)處理，轉(zhuǎn)移到第二個生物反應(yīng)器中，已在 Jacob Arthur Tijsterman（2015 年）的研究中進(jìn)行了描述。但是，這些工藝概念的概念驗證數(shù)據(jù)仍然缺失。
在這項工作中，我們提出了一種新的工藝方案，其中僅使用一個生物反應(yīng)器并應(yīng)用培養(yǎng)基置換來強(qiáng)化常見的補(bǔ)料分批操作。這種新的強(qiáng)化工藝概念基于 FBC 提供的有益培養(yǎng)基置換，旨在實現(xiàn)更高的單位體積生產(chǎn)率，同時避免過度使用培養(yǎng)基和對廣泛過程控制的需求。這種新工藝基于中間收獲 (Intermediate Harvest) 步驟，在第一個培養(yǎng)階段之后，收獲產(chǎn)品，同時用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，然后返回同一個生產(chǎn)反應(yīng)器進(jìn)行第二個生產(chǎn)階段（圖 1）。新的強(qiáng)化工藝在小規(guī)模篩選系統(tǒng)中進(jìn)行了測試，以研究對培養(yǎng)的影響，并連續(xù)放大和進(jìn)一步優(yōu)化?？偟膩碚f，應(yīng)該使用規(guī)?？s小選項開發(fā)一個在生產(chǎn)率和培養(yǎng)基消耗方面具有有益特征的強(qiáng)化工藝。
圖 1. 中間收獲過程的示意圖。含有分泌物的細(xì)胞培養(yǎng)液從生物反應(yīng)器中收集，并通過一次性流化床離心機(jī)分離。之后，清洗后的細(xì)胞可以重新引入生產(chǎn)生物反應(yīng)器并用于新工藝。
圖 2. 在不同時間點進(jìn)行和不進(jìn)行完全培養(yǎng)基置換的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批 (std. FB) 培養(yǎng)隨時間推移的培養(yǎng)結(jié)果。 (A)、(B) 和 (C) 為在第 6 天（IH d6；n = 3）、第 9 天（IH d9；n = 3), 和第 11 天 (IH d11; n = 2) 進(jìn)行培養(yǎng)基置換時的活細(xì)胞密度（VCC）和活性（Via.）的變化，分別與標(biāo)準(zhǔn)FB (n = 3) 培養(yǎng)相比。培養(yǎng)基置換的各個時間點用虛線表示。 (D) 在整個培養(yǎng)期內(nèi)所有培養(yǎng)的 IVCC 值。 (E) 每個培養(yǎng)隨時間變化的細(xì)胞直徑。
圖 3. 在中間收獲 (IH) 和最終收獲 (EH) 的各個時間點進(jìn)行的小規(guī)模篩選的上清液分析。 (A) 在小規(guī)模篩選中每種方法的 mAb 累積量。 (B) IH 之前的第一個培養(yǎng)階段和 IH 和 EH (EH) 之間的第二階段的平均細(xì)胞特異性生產(chǎn)力。在 EH 之前的整個工藝持續(xù)時間內(nèi)計算控制 FB 的生產(chǎn)率。 (C) 在 IH 和 EH 的時間點，每種方法的 HCP 含量與表達(dá)的 mAb 的比率。
圖 4. IH 操作后從 5 L 反應(yīng)器轉(zhuǎn)移到 250 mL 縮小模型的培養(yǎng)結(jié)果。 (A) 標(biāo)準(zhǔn) FB、以 25 × 10^6 cells/mL (IH 25) 重新接種的IH方法以及優(yōu)化的IH工藝（IH opt.）隨時間變化的 VCC（實線）和活性（虛線）曲線。 (B) 所有方法隨時間的細(xì)胞直徑變化。 (C) 培養(yǎng)過程中的 mAb 滴度 (g/L)。 (D) 以 pg/c/d 為單位的細(xì)胞特異性生產(chǎn)力 (qP)，用于每個進(jìn)行的實驗的指數(shù)和穩(wěn)定階段。
圖 5. 標(biāo)準(zhǔn) FB (n = 2) 和優(yōu)化 IH 在 UniVessel 培養(yǎng)中的細(xì)胞和表達(dá)參數(shù)（IH opt.；n = 1）。 (A) 兩種方法的 VCC（實線）和活性（虛線）。 (B) 培養(yǎng)過程中的直徑。 (C) 兩個實驗隨時間的體積。 (D) 標(biāo)準(zhǔn)FB和優(yōu)化IH隨時間的滴度 (g/L)。 (E) 每種方法中 IH 和 EH（最終收獲）產(chǎn)生的 mAb 總量。 (F) 兩個實驗中針對指數(shù)階段（最多第六天）和穩(wěn)定階段（從第六天到結(jié)束）的 qP (pg/c/d) 。
圖 6. 標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批 (FB) 工藝和優(yōu)化的中間收獲（IH opt.）在第六天以及最終收獲 (EH) 中表達(dá)的 mAb 的糖基化百分比分布。
總結(jié)
在這項研究中，開發(fā)了一種介于灌流細(xì)胞培養(yǎng)和經(jīng)典 FB 培養(yǎng)之間的新型混合工藝。因此，研究了在普通 FB 培養(yǎng)過程中與 FBC 系統(tǒng) (IH) 進(jìn)行完整且快速的培養(yǎng)基置換的影響。我們的結(jié)果顯示，根據(jù) IH 的時間點，對培養(yǎng)有兩種不同的影響。在指數(shù)生長期，可以實現(xiàn)細(xì)胞的顯著延長增殖，從而導(dǎo)致更高的峰值細(xì)胞密度。相比之下，靜止期的 IH 會導(dǎo)致細(xì)胞增殖持續(xù)停滯，延長高細(xì)胞活性，并隨后延長工藝持續(xù)時間?？紤]到最終產(chǎn)品滴度沒有顯著差異，并且在后期時間點進(jìn)行IH操作時的雜質(zhì)/產(chǎn)品比率增加，因此選擇指數(shù)增長階段的 IH 進(jìn)行放大?？尚行砸约靶∫?guī)模的可比性可以在放大的系統(tǒng)中得到證明。此外，通過增加罐的利用率并隨后在 IH 操作后濃縮細(xì)胞，可以在后續(xù)步驟中進(jìn)一步優(yōu)化該工藝。結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)相比，啟用FBC 的新工藝允許每次運行的總產(chǎn)品產(chǎn)量增加 +154% mAb?？偟膩碚f，這項工作展示了一種創(chuàng)新的新方法，無需灌流細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的復(fù)雜集成即可強(qiáng)化常用的 FB 操作。此外，由于 IH 工藝的簡單性，可以將此應(yīng)用與各種其它強(qiáng)化方法（例如高密度接種 FB）相結(jié)合。此外，由于 FBC 系統(tǒng)已經(jīng)存在放大版本，已建立的過程應(yīng)該可以完全放大到 2000 L 規(guī)模。然而，仍然需要進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模（例如，2000 L）的概念驗證，這將是未來研究的重點。總的來說，提出的工作開辟了幾種新的可能性，來修改當(dāng)前的 FB 工藝，以顯著提高產(chǎn)品產(chǎn)量和生產(chǎn)率。
原文：L.N.Reger, M.Saballus, J.Matuszczyk, et al., Boosting Productivity for Advanced Biomanufacturing by Re-Using Viable Cells. Front. Bioeng. Biotechnol.,2023.
