本文是來(lái)自Ambrx, Inc. 和3M的研究人員發(fā)表的文章“Single-stage chromatographic clarification of Chinese Hamster Ovary cell harvest reduces cost of protein production”的內(nèi)容簡(jiǎn)介，詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參考原文。
使用一次性層析澄清裝置 (CCD) 開(kāi)發(fā)了單級(jí)澄清，以從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 收獲細(xì)胞培養(yǎng)液 (HCCF) 中回收重組蛋白。 CHO HCCF 的澄清是一個(gè)復(fù)雜且昂貴的過(guò)程，涉及多個(gè)離心和/或深層過(guò)濾步驟，以去除細(xì)胞和碎片并減少工藝相關(guān)雜質(zhì)，例如宿主細(xì)胞蛋白 (HCP)、核酸和脂質(zhì)。使用深層過(guò)濾時(shí)，過(guò)濾器鏈由多個(gè)不同比例、層數(shù)、孔徑和吸附特性的過(guò)濾器組成。深層過(guò)濾器與 0.2 微米膜過(guò)濾器相結(jié)合，基于尺寸排阻、吸附和基于電荷的機(jī)制澄清 HCCF，并提供強(qiáng)大的生物負(fù)荷控制。澄清過(guò)程的每個(gè)階段都需要時(shí)間、勞動(dòng)力和公用設(shè)施，每一步都會(huì)有產(chǎn)品損失。在這里，使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier（一種單級(jí) CCD）被確定為三級(jí)過(guò)濾系列的替代策略。 CCD 導(dǎo)致總體過(guò)濾面積更小，沖洗體積更小，收率更高。使用生物工藝成本模型，將單級(jí)澄清工藝與三級(jí)過(guò)濾工藝進(jìn)行了比較。通過(guò)將 CHO HCCF 澄清壓縮到單級(jí)層析，澄清工藝的總成本降低了 17%-30%，具體取決于生物反應(yīng)器規(guī)模。成本降低的主要驅(qū)動(dòng)因素是總過(guò)濾面積、勞動(dòng)力、時(shí)間和公用設(shè)施的減少。單級(jí)收獲工藝的優(yōu)勢(shì)延伸到整個(gè)下游工藝，導(dǎo)致累積收率相對(duì)增加 25%，雜質(zhì)清除率相當(dāng)。
治療性蛋白質(zhì)，包括單克隆抗體 (mAb)、雙特異性抗體、細(xì)胞因子和酶，通常使用補(bǔ)料分批或灌流哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)由細(xì)胞表達(dá)和分泌。使用離心和/或深層過(guò)濾作為主要回收步驟從收獲細(xì)胞培養(yǎng)液 (HCCF) 中回收目標(biāo)蛋白，以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，并減少工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞蛋白、核酸、和脂質(zhì)。
使用離心或深層過(guò)濾是一個(gè)特定于產(chǎn)品的決定，其中生產(chǎn)的規(guī)模和臨床階段（例如，I期或商業(yè)化）、資本設(shè)備、成本、可清潔性和設(shè)施（專用或多產(chǎn)品）等因素是經(jīng)過(guò)考慮的。與連續(xù)流離心相比，深層過(guò)濾單元操作的開(kāi)發(fā)沒(méi)有那么復(fù)雜，這轉(zhuǎn)化為可預(yù)測(cè)的放大和易用性。支持早期生產(chǎn)的多產(chǎn)品設(shè)施，如合同開(kāi)發(fā)和制造組織 (CDMO)，依靠一次性深層過(guò)濾作為主要澄清步驟，最終提高設(shè)施的靈活性、產(chǎn)能和生產(chǎn)力。此外，與離心分離相比，一次性深層過(guò)濾顯著減少了清潔驗(yàn)證要求以及因產(chǎn)品轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致的設(shè)施停機(jī)時(shí)間。
在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞表達(dá)的重組非抗體蛋白產(chǎn)品的 1 期臨床生產(chǎn)工藝的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，開(kāi)發(fā)了一種基線、兩級(jí)深層過(guò)濾工藝，以從細(xì)胞培養(yǎng)液（CCF)中回收目標(biāo)蛋白 (圖 1A)。經(jīng)過(guò)一系列正交層析分離，包括陽(yáng)離子交換（CEX）、混合模式陰離子交換（MAX）、混合模式交換（MCX）、聚乙二醇化和進(jìn)一步純化，藥物底物 (DS) 中殘留的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）水平約為 200 ng HCP/mg 產(chǎn)品。使用沉淀助劑、洗滌緩沖液添加物、填料篩選（疏水相互作用層析 (HIC)、陰離子交換 (AEX)、陽(yáng)離子交換 (CEX) 和混合模式 (MM)）探索了其它 HCP 降低策略，結(jié)果幾乎沒(méi)有進(jìn)一步減少 HCP 的效果。
基于 AEX 纖維層析技術(shù)的一次性澄清裝置（3M Emphaze AEX Hybrid Purifier）作為 HCCF 澄清系列的第三級(jí)引入，導(dǎo)致 HCP 水平額外降低 50%（圖 1B）。初級(jí)、二級(jí)和三級(jí)澄清階段串聯(lián)操作，正面表面積比為 3:3:1。純化和聚乙二醇化后，在藥物物質(zhì) (DS) 中測(cè)得的 HCP 水平約為 10 ng HCP/mg 產(chǎn)品，表明層析澄清階段相對(duì)于兩級(jí)深層過(guò)濾系列提供了額外的 1.3 LRV。
最近，出現(xiàn)了一種新的解決方案，它采用纖維層析法高效且可放大地去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片和關(guān)鍵的可溶性污染物。 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier是一種單級(jí)層析澄清裝置 (CCD)，由 AEX 季銨 (Q) 配體功能化聚丙烯纖維床和 0.2 um 膜組成。在細(xì)胞培養(yǎng)澄清過(guò)程中，細(xì)胞和細(xì)胞碎片靜電結(jié)合到 AEX 纖維上，從而有效保留大顆粒和小顆粒，而不會(huì)形成表面餅層。與離心或傳統(tǒng)深層過(guò)濾相比，帶電纖維介質(zhì)還能夠有效去除與可溶性工藝相關(guān)的雜質(zhì)（即宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸），從而產(chǎn)生更清潔的流出物。 CCD 的推薦工作壓差為 ≤5 psi，從而減少細(xì)胞剪切和裂解，進(jìn)一步提高 HCCF 的質(zhì)量并最大限度地減少二硫化物還原的可能性。此外，與傳統(tǒng)的濕法深層過(guò)濾介質(zhì)相比，CCD 的合成 AEX 介質(zhì)在使用前需要更少的沖洗，從而節(jié)省了公用設(shè)施和時(shí)間。此外，水用作 CCD 沖洗液，因此無(wú)需緩沖液制備和相關(guān)緩沖液批記錄的質(zhì)量放行。
考慮到使用三級(jí)鏈有效澄清和去除 HCP 和 DNA，開(kāi)發(fā)了單級(jí)澄清作為直接替代，利用 CCD 的物理和靜電特性有效去除細(xì)胞、HCP 和 DNA（圖 1C）?；谶@些結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)澄清步驟所需的總過(guò)濾面積減少了 2.5 倍。純化和聚乙二醇化后，整個(gè)工藝過(guò)程的產(chǎn)量增加了約 25%，同時(shí)所有產(chǎn)品質(zhì)量屬性均符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，并與三級(jí)過(guò)濾器鏈相當(dāng)。
對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)澄清步驟的生產(chǎn)成本進(jìn)行建模，以使用三級(jí)與單級(jí)澄清方法的所有相關(guān)輸入來(lái)評(píng)估成本和節(jié)省。通過(guò)將 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)的澄清壓縮到一級(jí)，澄清工藝的總成本降低了 17%-30%，具體取決于規(guī)模（例如，生物反應(yīng)器體積）。成本降低的主要驅(qū)動(dòng)因素是總過(guò)濾面積、勞動(dòng)力和公用設(shè)施使用量的減少。隨著單級(jí)層析澄清工藝的實(shí)施，細(xì)胞培養(yǎng)澄清的總時(shí)間，包括準(zhǔn)備（纖維床沖洗和平衡）、產(chǎn)品過(guò)濾和洗滌，減少了大約 50%。
詳細(xì)試驗(yàn)操作、結(jié)果和討論，請(qǐng)參考原文。
圖 1. 生產(chǎn)非抗體蛋白產(chǎn)品的工藝流程。 (a) 使用 3M Zeta Plus Filter Capsules 10SPO2A 和 90ZBO5A 進(jìn)行兩級(jí)深層過(guò)濾，(b) 使用 Zeta Plus Filter Capsules 10SPO2A 和 9OZBO5A 以及 3M Emphaze AEX Hybrid Purifier進(jìn)行三級(jí)過(guò)濾，以及 (C) 單級(jí)層析澄清使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier。澄清后，所有鏈均通過(guò)相同的下游純化單元操作進(jìn)行處理：結(jié)合-洗脫陽(yáng)離子交換層析、流穿混合模式陰離子交換層析、結(jié)合-洗脫混合模式陽(yáng)離子交換層析、聚乙二醇化以及結(jié)合-洗脫陽(yáng)離子交換層析。
圖 2. 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier經(jīng)過(guò) SEM 制備步驟（例如固定、脫水、臨界點(diǎn)干燥和金濺射涂層）后的掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像。在澄清前 (a,b) 和 HCCF 澄清后 (c, d) 從裝置中提取纖維介質(zhì)層。 (a) 和 (c) 中的紅色框分別表示 (b) 和 (d) 的放大圖像。
圖 3. (a) 鏈1-4 HCCF 的非還原 SDS-PAGE。 (b) 鏈 1-4 的 HCCF 的宿主細(xì)胞蛋白 (HCP) 分析。
圖 4. 三級(jí)過(guò)濾（鏈 3）和使用 3M Harvest RC Chromatographic Clarifier（鏈5）的單級(jí)層析澄清的壓差曲線。
圖5. 鏈2、鏈3和鏈5的細(xì)胞培養(yǎng)起始材料以及澄清濾液樣品的濁度(NTU)值(未酸化和酸化)。
圖6. 來(lái)自不同收獲策略（鏈1-5）的 (a) 宿主細(xì)胞蛋白 (HCP) 水平和 (b) 工藝中間體的累積產(chǎn)量。
圖7. (a) 單次運(yùn)行不同體積生物反應(yīng)器時(shí)，單級(jí)澄清 (鏈 5) 與三級(jí)澄清 (鏈 3) 相比節(jié)省的運(yùn)行成本 (過(guò)濾器、人工、水和管路) 節(jié)省百分比。(b) 總費(fèi)用節(jié)約，包括資本設(shè)備 (操作費(fèi)用和過(guò)濾器支架)，與不同生物反應(yīng)器體積下批次數(shù)的關(guān)系。
圖8. 不同生物反應(yīng)器體積下單級(jí)和三級(jí)澄清工藝純化原料藥每克標(biāo)準(zhǔn)化成本 (數(shù)據(jù)歸一化為200L三級(jí)澄清)。
總結(jié)
將澄清單元操作壓縮到單級(jí) CCD 可降低細(xì)胞培養(yǎng)澄清步驟的成本，減少與工藝相關(guān)的雜質(zhì)（HCP 和 DNA），并提高生產(chǎn)率。單次運(yùn)行的運(yùn)營(yíng)成本節(jié)省減少了 17-30%，具體取決于生物反應(yīng)器規(guī)模?？紤]到資本設(shè)備的成本，200 L和 2000 L生物反應(yīng)器在 100 個(gè)批次后的總體成本節(jié)約分別為 29% 和 19%。在細(xì)胞培養(yǎng)澄清階段（鏈3和鏈5）增加的 HCP 減少量減少了層析單元操作的負(fù)擔(dān)，并在工藝過(guò)程結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)化為更低的 HCP 水平。層析澄清（鏈3和鏈5）導(dǎo)致兩個(gè)工藝的 HCP 水平（10 ng HCP/mg 產(chǎn)品）完全符合規(guī)格（低于 100 ng HCP/mg 產(chǎn)品）。通過(guò)強(qiáng)化細(xì)胞培養(yǎng)澄清步驟，與三級(jí)工藝相比，總體相對(duì)收率增加了 25%。因此，每克純化原料藥的澄清步驟成本降低了 40%。單級(jí) CCD 已成功放大用于 GMP 生產(chǎn)，并產(chǎn)生與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模相當(dāng)?shù)氖章屎?HCP 水平。
原文：B.O'Mara, N.K.Singh, A. Menendez., Single-stage chromatographic clarification of Chinese Hamster Ovary cell harvest reduces cost of protein production. Biotechnology Progress, 2023.
